蠲痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型細(xì)胞因子的影響

俞 琦 蔡 琨 王文佳

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

藥物研究

蠲痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型細(xì)胞因子的影響

俞 琦 蔡 琨 王文佳

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

目的：觀察蠲痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）、血清細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β、IL－4、IL－10水平的影響，探討蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫機(jī)制。方法：將大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、甲氨喋呤對照組、蠲痹湯高／低劑量組，制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，給藥組以不同劑量蠲痹湯灌胃，對照組代以生理鹽水，檢測AI、血清細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β、IL－4、IL－10的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清TNF－α、IL－1β水平明顯上升，IL－10、IL－4水平明顯下降（P＜0.01）；與模型對照組比較，蠲痹湯高、低劑量均能明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠AI和血清TNF－α、IL－1β水平（P＜0.05或P＜0.01），對IL－4水平無影響（P＞0.05），蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL－10水平（P＜0.01）。結(jié)論：蠲痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠TNF－α等炎癥因子具有干預(yù)作用，提示蠲痹湯可通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF－α、IL－1的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL－10的分泌，從而達(dá)到治療RA的效果。

蠲痹湯；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；大鼠模型；細(xì)胞因子

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）屬難治性疾病，臨床多采用化學(xué)藥物或生物制劑進(jìn)行治療，但療效不穩(wěn)定。蠲痹湯出自清代程國彭所著 《醫(yī)學(xué)心悟》，由獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、炙甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成，具有祛風(fēng)除濕、益氣活血、蠲痹止痛等功效，是臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的常用方劑，療效顯著［1－3］。為探討其作用機(jī)制，本研究通過制備類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型，以血清細(xì)胞因子為觀察指標(biāo)，觀察蠲痹湯對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步研究蠲痹湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠50只（180±20）g（雌雄分籠），由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供 ［許可證號：SCXK（黔）2002－0001］。

1.2 藥材與試劑 蠲痹湯：按原方比例常規(guī)方法制備水煎劑，調(diào)整濃度為0.1g生藥／ml，濾過除菌，置4℃?zhèn)溆?；甲氨喋呤（上海華聯(lián)制藥有限公司）；完全福氏佐劑 （Sigma公司）；大鼠細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β、IL－10、IL－4檢測試劑盒 （上海拜力生物科技有限公司）。

1.3 儀器 EIX808U型全自動酶標(biāo)儀（美國BioTek）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組 動物購回適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為2組。正常對照組大鼠10只；模型組大鼠40只，造模后又隨機(jī)分為模型對照組、甲氨喋呤對照組、蠲痹湯高劑量組、蠲痹湯低劑量組，每組10只。

2.2 大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的制備［4］模型組大鼠左后足跖皮內(nèi)注射完全福氏佐劑，0.1ml／只，建立佐劑性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠病理模型。

2.3 給藥方法 造模后第7d，甲氨喋呤對照組按1.2 mg／kg灌服，1次／d，連續(xù)2周；蠲痹湯高、低劑量組分別按2.2g／kg、1.1g／kg灌服，1次／d；正常對照組和模型對照組灌服等量生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥2周。

2.4 關(guān)節(jié)炎指數(shù)（arthritis index，AI）的計(jì)算［5］大鼠致炎后第12d開始觀察并記錄關(guān)節(jié)病變程度，每4d1次，病變按5級分法評價，根據(jù)未注射佐劑的余下肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI。

2.5 指標(biāo)檢測 末次灌胃12h后開始禁食（不禁水），24h后股靜脈取血，分離血清，細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β、IL－4、IL－10水平的檢測均按試劑盒說明書操作。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響 由表1可知，致炎后16d，蠲痹湯高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著低于模型對照組（P＜0.05）；致炎后20d，蠲痹湯高、低劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)均較模型對照組明顯降低 （P＜0.05）；從致炎16d起，蠲痹湯高、低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與甲氨喋呤對照組近似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù) （分，x±s）

3.2 對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響 由表2可知，與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β水平明顯上升，IL－10、IL－4水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01）；與模型對照組比較，蠲痹湯高、低劑量組均能明顯降低RA模型大鼠血清TNF－α、IL－1β水平（P＜0.01或P＜0.05），對IL－4水平均無影響（P＞0.05）。蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL－10水平（P＜0.01）。

表2 蠲痹湯對RA大鼠血清細(xì)胞因子水平的影響 （x±s）

4 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種累及周圍關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)性自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇。多因風(fēng)寒濕熱等外邪侵襲人體，閉阻經(jīng)絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢所致。本病較為常見，且是頑固的慢性關(guān)節(jié)炎癥性病變，常侵犯四肢小關(guān)節(jié)，可引起全身的關(guān)節(jié)腫脹疼痛及功能障礙，并可伴有關(guān)節(jié)外的系統(tǒng)性損害，是致殘性疾病之一。臨床上多采用化學(xué)藥物或生物制劑進(jìn)行治療，但其毒副作用明顯、患者難以長期耐受，且療效不穩(wěn)定。近年來，用中醫(yī)中藥辨證治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎取得很好療效。蠲痹湯源自 《醫(yī)學(xué)心悟》，由獨(dú)活、桂心、秦艽、當(dāng)歸、川芎、炙甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成，是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎常用方劑，療效顯著。

研究表明，在RA的發(fā)病過程中，細(xì)胞因子的失調(diào)占有重要的地位，TNF－α、IL－1β主要由單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌，使外周血和關(guān)節(jié)滑液中IL－1β和TNF－α升高。IL－1β和TNF－α是炎癥、組織損傷及免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，在RA的發(fā)病機(jī)理中居中心地位，參與RA的發(fā)生發(fā)展過程，二者相互協(xié)調(diào)、促進(jìn)，在多數(shù)情況下表現(xiàn)協(xié)同性生物學(xué)效應(yīng)［6］。表達(dá)的IL－1β和TNF－α可刺激滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬酶、膠原酶等，導(dǎo)致滑膜炎癥和軟骨破壞，同時可激活破骨細(xì)胞，使骨質(zhì)溶解［7］。IL－4和IL－10是兩種抗炎癥的Th2型細(xì)胞因子，可負(fù)調(diào)節(jié)抗原提呈細(xì)胞的功能，抑制Th1增生，抑制IL－1β、TNF－α和其他一些炎癥性細(xì)胞因子的功能和生成。IL－10、IL－4在RA病變中含量明顯降低。實(shí)驗(yàn)和臨床觀察證實(shí)，糾正促炎癥細(xì)胞因子和抗炎癥細(xì)胞因子的平衡失調(diào)狀態(tài)，可以緩解或阻止關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生和發(fā)展［8］。

本研究結(jié)果顯示，致炎20d后，與模型對照組比較，蠲痹湯高、低劑量均能顯著降低實(shí)驗(yàn)大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù) （P＜0.05）；從致炎16d起，蠲痹湯高、低劑量組關(guān)節(jié)炎指數(shù)與甲氨喋呤對照組近似，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＞0.05），表明蠲痹湯能抑制大鼠RA的繼發(fā)病變。與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清TNF－α、IL－1β水平明顯升高，IL－10、IL－4水平明顯降低（P＜0.01），提示模型大鼠淋巴細(xì)胞免疫功能下降，炎性細(xì)胞因子分泌增多，抗炎性細(xì)胞因子減少，促進(jìn)了RA的發(fā)生發(fā)展。與模型對照組比較，蠲痹湯高、低劑量能明顯降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清TNF－α、IL－1β水平（P＜0.01或P＜0.05），蠲痹湯高劑量組能顯著升高模型大鼠IL－10水平（P＜0.01），說明蠲痹湯在一定劑量下對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型的免疫功能及紊亂的細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)作用，提示蠲痹湯可通過抑制炎性細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β的表達(dá)，促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子IL－10的分泌，從而達(dá)到治療RA的效果。經(jīng)蠲痹湯治療后，模型動物IL－4水平不發(fā)生變化，提示其不能調(diào)節(jié)IL－4的表達(dá)。

佐劑性關(guān)節(jié)炎動物模型與人類RA有較高的相似度，利用該模型對RA治療藥物篩選具有重要的應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)采用佐劑性關(guān)節(jié)炎癥動物模型進(jìn)行研究的結(jié)果表明：蠲痹湯對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠足關(guān)節(jié)病變有顯著抑制作用，其臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫有關(guān)。

［1］王建文.蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎60例［J］.吉林中醫(yī)藥，2003，23（12）：26.

［2］史成和，關(guān)曉旭.和血蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎90例 ［J］.陜西中醫(yī)，2004，25（7）：614－616.

［3］肖一公.自擬祛風(fēng)蠲痹湯治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效觀察 ［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2007，19（4）：319－320.

［4］周軍，方素萍，齊云，等.桂枝湯對大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的防治作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2000，16（6）：319－323.

［5］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) （第三版）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

［6］李霞，孫健，范成明.細(xì)胞因子與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 ［J］.大連大學(xué)學(xué)報，2000，21（4）：102－105.

［7］Miossec P1，van den Berg W.Th1／Th2 cytokine balance in arthritis［J］. Arthritis Rheum，1997，40（12）：2105－15.

［8］Neurath MF，Hildner K，Becker C，et al.Methotrexate specifically modulates cytokine production by T cells and macrophages in murine collagen－induced arthritis（CIA）：a mechanism for methotrexate－mediated immunosuppression［J］.Clin Exp Immunol 1999，115（1）：42－55.

R285.5

A

1007－8517（2015）14－0001－02

2015.4.15）

貴陽中醫(yī)學(xué)院2007年科研基金項(xiàng)目。

俞琦（1978－），女，貴州貴陽人，碩士，副教授，主要從事中西醫(yī)結(jié)合研究。E－mail：sgyq.a＠163.com