高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方清肺飲顆粒中淫羊藿苷的含量研究

施元洪劉鎮(zhèn)峰李鎮(zhèn)波陳玉興

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東汕頭515041；2.廣東省汕頭市皮膚性病防治院藥劑科，廣東汕頭515041；3.廣東省汕頭市濠江區(qū)河浦人民醫(yī)院藥劑科，廣東汕頭515098；4.廣東省中醫(yī)研究所中藥室，廣州515000

高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方清肺飲顆粒中淫羊藿苷的含量研究

施元洪1劉鎮(zhèn)峰2李鎮(zhèn)波3陳玉興4

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，廣東汕頭515041；2.廣東省汕頭市皮膚性病防治院藥劑科，廣東汕頭515041；3.廣東省汕頭市濠江區(qū)河浦人民醫(yī)院藥劑科，廣東汕頭515098；4.廣東省中醫(yī)研究所中藥室，廣州515000

目的建立用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定復(fù)方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量的方法。方法采用C18色譜柱（200mm×4.6mm，5μm三津特納）；流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm?？疾旃┰嚻泛停ɑ颍?duì)照品溶液的線性關(guān)系，HPLC的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率試驗(yàn)和樣品測(cè)定。結(jié)果淫羊藿苷在4～36μg/ml（r=0.9998）范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。平均回收率為98.11%，RSD為2.55%。結(jié)論采用HPLC測(cè)定復(fù)方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量操作方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，重復(fù)性好，可有效地用于復(fù)方清肺飲顆粒的質(zhì)量控制。

復(fù)方清肺飲顆粒；淫羊藿苷；高效液相色譜法

復(fù)方清肺飲顆粒是本醫(yī)院的中藥自制制劑，組方：金銀花、黃芩、連翹、淫羊藿、紫花地丁、桔梗、枇杷葉、桑白皮等。臨床上用于治療肺、胃熱盛型的痤瘡、脂溢性皮炎等癥，效果確切。該方藥味眾多，成分復(fù)雜，其性質(zhì)各不相同，為保證本制劑的科學(xué)性和質(zhì)量穩(wěn)定，本文采用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方清肺飲顆粒方中主藥之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

JASCO 2000高效液相色譜儀（日本分光株式會(huì)社）；島津LC-10ATVP泵；ME5型精密電子分析天平（瑞士梅特勒．托利多公司）；ANASTAR色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)（美國(guó)TS公司）；BRANSO NSB3200超聲波清洗器；Sartorius PH酸度計(jì)（德國(guó)塞多利斯公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；SK 5200H型超聲波提取機(jī)（中國(guó)科導(dǎo)超聲儀器有限公司制造）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定提供，供含量測(cè)定用），復(fù)方清肺飲藍(lán)顆粒為廣東省汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院自制，所用藥材均為生產(chǎn)用同批藥。乙腈均為色譜純（CALEDON LABORATOR IESLTD．Canada），水為重蒸餾水，乙醇及其他試劑均為分析純。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 色譜條件

采用C18色譜柱（200mm×4.6mm，5μm三津特納），流動(dòng)相：乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 mm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μl。

1.3.2 溶液的制備

1.3.2.1 淫羊藿對(duì)照品配制精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品，加75%乙醇溶液制成1.31mg/ml的對(duì)照品溶液[1]。精密吸取對(duì)照品溶液5μl，注入液相色譜儀。保留時(shí)間（Rt）=7.966 min，分離度（Rs）=10.78。

1.3.2.2 供試品溶液的制備精密稱取復(fù)方清肺飲顆粒內(nèi)容物1 g，置于錐形瓶中，精密稱定，精密加入75%乙醇溶液50 ml，密塞，稱定重量，超聲提取30 mim，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取連續(xù)濾液15 ml，用75%乙醇溶液定容于25ml容量瓶中，即得。精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀[2]。Rt=8.111min，Rs=8.17。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品1.4mg，置50ml容量瓶中，加75%乙醇溶液溶解并稀釋至刻度，精密吸取該溶液1、3、5、7、9ml置25ml容量瓶中，加75%乙醇溶液配制成濃度為2.8、5.6、11.2、22.4、28.0μg/ml的對(duì)照品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行性回歸，得回歸方程為A=27569．38C+ 6275．3（r=0.9998），線性范圍為4～36μg/m1。

2 結(jié)果

2.1 精密度試驗(yàn)

按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行樣品采集。吸取溶液20μl，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定淫羊藿苷色譜峰面積積分值，結(jié)果RSD=1.02%（n=6）（表1）。

表1 淫羊藿苷樣品精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行樣品采集。按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜條件于0、1、2、4，8、16、24 h時(shí)，分別進(jìn)樣20μl，測(cè)定淫羊藿苷峰面積積分值，RSD=1.02%（n=7），結(jié)果表明，樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定（表2）。

表2 淫羊藿苷樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20130413），按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行樣品采集，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，色譜條件平行測(cè)定6次，結(jié)果，平均含量為769．56μg/g，RSD=1.17%（表3）。

表3 淫羊藿苷樣品重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 加樣回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知含量的樣品適量，并準(zhǔn)備加入一定量的淫羊藿苷對(duì)照品，按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行樣品采集，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算回收率，樣品中淫羊藿苷的含量測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 樣品中淫羊藿苷的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定

精密稱取4批樣品各1 g，按“1.3.2.2”供試品溶液的制備方法進(jìn)行樣品采集，即得制成供試品溶液，按“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別測(cè)定淫羊藿苷含量，結(jié)果見表5。

表5 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

復(fù)方清肺飲顆粒藥味眾多，成分復(fù)雜，其性質(zhì)各不相同。方中淫羊藿的主要成分為淫羊藿苷，相關(guān)研究表明，淫羊藿苷對(duì)家兔有降低外周阻力和較緩和的降壓作用，還能提高腎上腺皮質(zhì)功能。為保證本制劑的科學(xué)性和質(zhì)量穩(wěn)定，本文根據(jù)《中國(guó)藥典》（2005年版·一部）采用高效液相色譜法對(duì)復(fù)方清肺飲顆粒方中主藥之一淫羊藿的主要有效成分——淫羊藿苷的含量進(jìn)行測(cè)定。目前高效液相色譜法已逐漸成為中藥檢驗(yàn)的最重要分析手段，在中藥及天然藥物有效成分含量測(cè)定中發(fā)揮日益重要的作用[3-4]，對(duì)于其藥效、藥理學(xué)的研究具有重要意義，但尚不能全面而準(zhǔn)確地反映附子藥材中的精確藥效成分[5]。曾試過乙腈-水（25∶75）作為流動(dòng)相，結(jié)果淫羊藿苷與鄰近峰分離不理想，最后改用高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方清肺飲顆粒中淫羊藿苷含量，本方法峰形對(duì)稱，且分離度較好。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，淫羊藿苷在4～36μg/ml范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（r=0.9998）。平均回收率為98.11%，RSD為2.55%。在提取方法的選擇方面，則選用目前通用的標(biāo)準(zhǔn)方法，即根據(jù)淫羊藿的性質(zhì)進(jìn)行提取。在線性關(guān)系考察、精密度實(shí)驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)和樣品測(cè)定等方面，本研究結(jié)果與類似文獻(xiàn)[6-15]研究水平基本一致。

綜上所述，高效液相色譜法能夠較好地分離淫羊藿中的淫羊藿苷成分，高效液相色譜法操作簡(jiǎn)便、分離效果好，重現(xiàn)性高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用意義。

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Content study of icariin in com pound qingfeiyin granule determ ined by high performance liquid chromatography

SHIYuan-hong1LIU Zhen-feng2LIZhen-bo3CHEN Yu-xing4
1.Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College in Guangdong Province, Shantou 515041,China;2.Department of Pharmacy,Prevention and Treatment Hospital of Skin Venereal Disease of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515041,China;3.Department of Pharmacy,Hepu People′s Hospital in Haojiang District of Shantou City in Guangdong Province,Shantou 515098,China;4.Room of Chinese Materia Medica, Guangdong Institute of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 515000,China

Objective To establish themethod of determining icariin content from compound qingfeiyin granule by high performance liquid chromatography(HPLC).M ethods C18chromatographic column(200 mm×4.6 mm,5μm three jin turner)was applied.Themobile phase was acetonitrile and water in ratio of 30 to 70.The detection wavelength was 270 nm.The linear relation of test samples solution and(or)reference sample solution was observed.The precision,stability, and repeatability of HPLC,added recovery rate test,and sample determination were also observed.Results Icariin had a good linear relation ranging from 4μg/ml to 36μg/ml(r=0.9998).The average recovery rate was 98.11%,and relative standard deviation(RSD)was 2.55%.Conclusion Operational approach of content determination of icariin in compound qingfeiyin granule by HPLC is simple and accurate with high sensitivity and good repeatability,it can be effectively used in quality control of compound qingfeiyin granule.

Compound qingfeiyin granule;Icariin;High performance liquid chromatography

R927.2

A

1674-4721（2015）04（c）-0007-03

2014-12-24本文編輯：許俊琴）

廣東省汕頭市醫(yī)療科技計(jì)劃項(xiàng)目（汕府科[2013] 88號(hào)）