TGFβ1誘導(dǎo)的肝臟前體細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換在逆轉(zhuǎn)過程中可影響星狀細胞活化

趙文姍 楊愛婷 孫亞朦 賈繼東 尤紅

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的主要因素［1］。當(dāng)慢性肝損傷時，肝細胞再生受到抑制，此時肝臟前體細胞(hepatic progenitor cells，HPC)可被激活，通過分化成肝細胞和膽管細胞對肝臟損傷產(chǎn)生應(yīng)答并進行修復(fù)［2-3］。

Lorizini等［4］發(fā)現(xiàn)，在大鼠或小鼠肝臟受損模型和人類慢性乙型肝炎、丙型肝炎纖維化組織中，激活的HPC常與肝HSC伴行。經(jīng)TGFβ1刺激后的HPC在與HSC利用Transwell間接共培養(yǎng)時，可影響HSC的活化。其中，TGFβ1在體外培養(yǎng)中可誘導(dǎo)HPC發(fā)生上皮-間 質(zhì) 轉(zhuǎn) 換 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)［5］。而用HPC的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC時，則不能活化HSC。因此，前體細胞是否只有在TGFβ1升高的情況下才會對HSC發(fā)揮作用，尚不清楚。

本研究使用大鼠肝臟WB-F344和HSC-T6細胞系作為HPC和HSC體外研究的模型，通過條件培養(yǎng)基體系，觀察HPC經(jīng)TGFβ1刺激后，其條件培養(yǎng)基對HSC活化及細胞外基質(zhì)的影響。

材料和方法

一、主要材料

大鼠肝臟前體細胞系WB-F344由軍事醫(yī)學(xué)院裴雪濤教授贈送，大鼠肝星狀細胞(T6)系由美國紐約西奈山醫(yī)學(xué)院Friedman教授贈送。DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司。TGFβ1購自PeproTech公司(100-21C)。反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Green實時熒光定量PCR試劑購自美國ABI公司。引物序列由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。大鼠Ⅰ型膠原(collagen-Ⅰ，Col-Ⅰ)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(Rat0513)購自美國 Andy Gene公司。Western印跡所用的第一抗體詳見表1，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物公司。

表1 Western印跡抗體及條件

二、方法

(一)條件培養(yǎng)基間接共培養(yǎng)體系的建立

前體細胞復(fù)蘇后用含 10%FBS的 DMEM(含100 U/mL青霉素，100 μg/mL 鏈霉素)，于 37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的前體細胞，消化后制備成單細胞懸液，根據(jù)需要以適當(dāng)密度接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后棄去舊培養(yǎng)基，換成TGFβ1濃度為10 ng/mL的10%FBS的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) 6、12、24、36或48 h。棄掉含 TGFβ1培養(yǎng)基，PBS洗細胞一次，換含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液及細胞，提取細胞總蛋白，并以不加任何處理因素為對照組。

同取對數(shù)生長期的HSC細胞，以每皿5×105個接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，換上述收集的條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細胞，提取細胞總蛋白及RNA。

(二)HSC及前體細胞總蛋白的提取及Western印跡

將上述收集的HSC及前體細胞，予以蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒對蛋白質(zhì)進行定量后，每組取30 μg總蛋白上樣。12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，濕轉(zhuǎn)恒流390 mA 55 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別加入α-SMA及TIMP-1的一抗，4℃孵育過夜，充分洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(1∶8 000稀釋)和山羊抗兔二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育l h，充分洗滌后發(fā)光、顯影、定影、曝光及掃描。內(nèi)參對照β-actin用洗膜液于室溫孵育40 min洗膜后重新封閉，加入β-actin一抗和相應(yīng)二抗孵育。

(三)HSC-T6細胞總mRNA的提取及實時熒光定量PCR

按照Trizol Reagent試劑盒說明書的步驟提取細胞總mRNA，按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將4 μg mRNA 反轉(zhuǎn)錄，得到50 μL cDNA。采用實時熒光定量PCR檢測各組細胞中相應(yīng)指標(biāo)的變化，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。引物序列見表2。DNA序列由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。實時熒光定量PCR反應(yīng)條件:95℃ 10 min;94℃ 15 s，60℃ 60 s，循環(huán)40 次。

表2 實時PCR引物序列

(四)ELISA法檢測條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的含量

按照ELISA試劑盒說明書的步驟檢測上述所收集的條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的含量。經(jīng)過加樣、溫育、配液、加酶、洗滌、顯色及終止反應(yīng)等步驟后，用酶標(biāo)儀450 nm讀數(shù)，測定各孔A值。以A值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)上清液的A值計算出其濃度。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件行單因素方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、TGFβ1對肝臟前體細胞形態(tài)學(xué)的影響

利用 TGFβ1(10 ng/mL)刺激 HPC 6、12、24、36 及48 h，以新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)相應(yīng)時間點的細胞作為對照組，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化。結(jié)果TGFβ1刺激后細胞明顯變大變圓，胞質(zhì)比例明顯增加，核質(zhì)比減少。隨著TGFβ1藥物作用時間的增加，上述變化更為明顯(見圖1)。

二、去除TGFβ1刺激后，其誘導(dǎo)的EMT可逆轉(zhuǎn)

用TGFβ1刺激前體細胞不同時間點后，棄掉上清液，換新鮮培養(yǎng)基再培養(yǎng)48 h(見圖2A)。發(fā)現(xiàn)短期刺激后前體細胞表現(xiàn)為間質(zhì)細胞特點，主要表現(xiàn)為間質(zhì)細胞標(biāo)志物α-SMA的表達升高，6 h及12 h分別為對照組的2.2 倍(P=0.01)及 2.62 倍(P=0.28);隨著刺激超過24 h，與對照組相比，α-SMA的表達無明顯變化，24、36及 48 h分別為對照組的 1.31倍(P ＞0.05)、0.97 倍(P=0.027)及 1.08 倍(P=0.058)。(見圖 2B)。

三、條件培養(yǎng)基間接共培養(yǎng)未能改變HSC細胞形態(tài)

將培養(yǎng)過TGFβ1預(yù)刺激后的前體細胞48h的培養(yǎng)基收集、離心、過濾后作用于HSC，以培養(yǎng)過未經(jīng)處理前體細胞的條件培養(yǎng)基作為對照組，使用普通倒置顯微鏡觀察各組HSC細胞形態(tài)(見圖3)。TGFβ1預(yù)刺激后的條件培養(yǎng)組的HSC細胞形態(tài)與對照組無差別，各組細胞呈梭形。

圖1 TGFβ1作用于HPC不同時間點后，前體細胞形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯變化(倒置顯微鏡×10)

圖2 去除TGFβ1刺激后，其誘導(dǎo)的前體細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換可發(fā)生逆轉(zhuǎn)

圖3 TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養(yǎng)基未能改變HSC細胞形態(tài)倒置顯微鏡(×10)

四、條件培養(yǎng)基對HSC細胞活化及細胞外基質(zhì)的作用

與未經(jīng)處理的WB-F344細胞條件培養(yǎng)基相比，TGFβ1刺激6h后的WB-F344細胞條件培養(yǎng)基能夠促使HSC活化指標(biāo)α-SMA和細胞外基質(zhì)指標(biāo)TIMP-1在蛋白水平表達升高;這兩個指標(biāo)在基因水平上也呈升高趨勢，分別升高4.12倍(P=0.008)及 2.64倍(見圖4A、4B)。然而，經(jīng)TGFβ1刺激24 h后的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)后上述作用相反，主要表現(xiàn)為:α-SMA的蛋白表達降低，而TIMP-1的表達無明顯變化;α-SMA和TIMP-1基因水平變化分別為，24 h為對照組0.81 倍及0.98 倍，36 h為0.96 倍及0.61 倍，48 h為0.63倍及0.76倍(見圖4B)，呈降低趨勢。

圖4 TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養(yǎng)基，對HSC細胞活化及細胞外基質(zhì)表達的變化

五、TGFβ1刺激前體細胞后的條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的表達無顯著變化

我們用酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測所收集的條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的含量，結(jié)果顯示，TGFβ1刺激后的前體細胞條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的含量，與未經(jīng)處理的條件培養(yǎng)基相比并無明顯差異(P＞0.05)(見圖5)。這說明，條件培養(yǎng)基對HSC活化及細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的作用可能與Col-Ⅰ的分泌無關(guān)。

圖5 TGFβ1刺激WB-F344后的條件培養(yǎng)基中Col-Ⅰ的表達量并無明顯變化

討 論

慢性肝損傷時，HPC與HSC的密切聯(lián)系使得人們越來越關(guān)注HPC能否通過調(diào)控HSC進而影響肝纖維的進展。本研究采用前體細胞體外模型WB-F344細胞株，其在不同誘導(dǎo)劑的作用下，能夠分化為成熟的肝臟細胞和膽管上皮細胞［7］。

細胞共培養(yǎng)技術(shù)可模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境，便于更好的觀察細胞與細胞、細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用以及探討藥物的作用機制和可能作用的靶點。Lin等［8］發(fā)現(xiàn)通過Transwell小室共培養(yǎng)體系，人多能間充質(zhì)干細胞分泌的神經(jīng)生長因子可促進HSC的凋亡并抑制增殖，進而起到抗肝纖維化的作用。既往研究顯示，經(jīng) TGFβ1刺激后的 HPC在與 HSC利用Transwell間接共培養(yǎng)時，可影響HSC的活化。TGFβ1是經(jīng)典的致纖維化誘導(dǎo)劑，慢性肝損傷時可升高。

本研究發(fā)現(xiàn)，前體細胞在去除TGFβ1刺激后，其間質(zhì)細胞標(biāo)志物的表達可逐漸下降，這在一定程度上說明前體細胞EMT發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。這可能與所換的新鮮培養(yǎng)基中FBS有關(guān)，因為FBS中含有的EGF可能促進了這一過程［6］。在EMT的逆轉(zhuǎn)過程中，其條件培養(yǎng)基又能夠?qū)SC的活化發(fā)揮作用。當(dāng)TGFβ1刺激前體細胞的時間相對較短，其條件培養(yǎng)基可促進HSC的活化;而當(dāng)逐漸增加刺激時間時，條件培養(yǎng)基反過來會抑制HSC的活化。這可能與前體細胞的狀態(tài)有關(guān)，前體細胞接受到外界損傷信號時，如果刺激輕微或時間較短，其并不能發(fā)揮損傷修復(fù)的作用，從而刺激HSC的活化;而當(dāng)刺激足夠強或時間長時，前體細胞才能啟動損傷修復(fù)機制，進而抑制HSC的活化。本研究為進一步探討HPC和HSC之間的相互作用以及治療肝纖維化提供了一定的實驗室基礎(chǔ)，但前體細胞逆轉(zhuǎn)過程中分泌的某種因子或通過某種基質(zhì)作用于HSC仍需進一步研究。

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