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    三七總皂苷對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO、TGF-β1、MMP-9的影響研究

    2015-06-04 06:26:00袁嘉麗萬(wàn)春平趙文娟陳一紓邢海晶
    關(guān)鍵詞:總皂苷細(xì)胞培養(yǎng)皂苷

    祁 燕,袁嘉麗,萬(wàn)春平,趙文娟,陳一紓,邢海晶

    (1.云南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,云南昆明650000;2.云南中醫(yī)學(xué)院,云南昆明650500)

    慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展,以氣道炎癥和氣道重建為主要特征,可以預(yù)防和治療的慢性肺部疾病。COPD氣道炎癥以中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主,其中巨噬細(xì)胞作為參與氣道固有免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞,廣泛分布在肺泡內(nèi)及支氣管表面,也是肺部接觸抗原較早、機(jī)會(huì)最多的免疫細(xì)胞,在氣道防御反應(yīng)中發(fā)揮吞噬作用的同時(shí)也參與了氣道炎癥的形成[1]。氣道反復(fù)的慢性炎癥刺激導(dǎo)致氣道壁組織損傷和異常修復(fù)過(guò)程反復(fù)進(jìn)行,在此異常修復(fù)過(guò)程中發(fā)生的氣道壁結(jié)構(gòu)重構(gòu)即氣道重建。氣道重建呈進(jìn)行性發(fā)展,最終造成氣道狹窄、氣流受限。所以,防治炎癥是COPD長(zhǎng)期以來(lái)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。當(dāng)巨噬細(xì)胞受到細(xì)菌內(nèi)毒素等因素刺激時(shí)被激活會(huì)釋放一系列細(xì)胞因子如一氧化氮(NO)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)等參與 COPD氣道炎癥及氣道重建等病理過(guò)程[2-4]。三七總皂苷是我國(guó)名貴中藥三七的主要活性成分,其可加快血流速度,降低血液黏度,改善機(jī)體微循環(huán);可緩解支氣管痙攣,抑制炎癥反應(yīng),改善肺泡通氣功能,促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD)患者的恢復(fù)[5]。其用于治療COPD也獲明顯療效[6-7]。課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也表明,三七總皂苷可降低COPD模型大鼠血清中TGF-β1、MMP-9水平,從而達(dá)到緩解COPD發(fā)展進(jìn)程中氣道炎癥及氣道重建的作用[8]。本研究以前期課題組用三七總皂苷干預(yù)COPD動(dòng)物模型的療效為基礎(chǔ),采用脂多糖(LPS)激活RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建COPD發(fā)病過(guò)程中氣道組織損傷的炎癥細(xì)胞模型,在細(xì)胞水平觀察三七總皂苷對(duì)巨噬細(xì)胞分泌及表達(dá)NO、MMP-9、TGF-β1的作用,以進(jìn)一步探討三七總皂苷防治COPD發(fā)病過(guò)程中氣道炎癥及氣道重建的效應(yīng)機(jī)制,為三七總皂苷臨床治療COPD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)資料

    1.1 藥物 三七總皂苷(注射用血塞通)購(gòu)自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司,400 mg/支,批號(hào):100707。地塞米松注射液購(gòu)自西南藥業(yè)股份有限公司,5 mg/支,批號(hào):120721。

    1.2 細(xì)胞 RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自GibcoBRL公司;胎牛血清購(gòu)自Hyclone;總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqⅡ均購(gòu)自TaKaRa;引物(TGF-β1,MMP-9)均由大連寶生物工程有限公司合成。恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Trermo公司,型號(hào):3111);ABI PCR儀(Gene公司,型號(hào):Veriti);安捷倫核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)儀(Gene公司,型號(hào):MX3000P);Epoch連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司。

    1.4 方法

    1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞,細(xì)胞經(jīng)傳代至4~5代,處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.4.2 MTT法測(cè)定三七總皂苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 RAW264.7細(xì)胞以1×109L-1接種于96孔板,每孔100 μL。細(xì)胞分為 3組:三七總皂苷組每孔加入不同濃度的三七總皂苷藥液(10,30,100,300,900,2700 μg/mL),地塞米松組每孔加入100 μg/mL地塞米松,正常對(duì)照組以1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。每組3個(gè)復(fù)孔,以37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后每孔加入終濃度5 mg/mL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸棄上清,每孔加入150 μL DMSO,震蕩10 min后在酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)各孔的吸光值(OD)。

    1.4.3 Griess法測(cè)定RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO的含量 RAW264.7細(xì)胞分為正常對(duì)照組(以1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、LPS組(1 μg/mL LPS)、LPS+三七總皂苷不同濃度組(1 μg/mL LPS+10,30,100,300 μg/mL 三七總皂苷)、LPS+地塞米松組(1 μg/mL LPS+100 μg/mL地塞米松)。細(xì)胞以1×109L-1接種于96孔板,每孔100 μL,每組重復(fù)3孔,同時(shí)按照分組加入對(duì)應(yīng)濃度藥物50 μL置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h 后,再加入1 μg/mL LPS 50 μL 以激活 RAW264.7 細(xì)胞。24 h后收取細(xì)胞培養(yǎng)上清,置于-20℃待測(cè)。檢測(cè)時(shí)以50 μL培養(yǎng)液上清與100 μL Griess混合試劑[1%對(duì)氨基苯磺酸溶液+0.1%N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽溶液等體積]充分混合、振搖10 min,酶標(biāo)儀上540 nm處測(cè)量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO釋放量。

    1.4.4 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TGF-β1、MMP-9含量檢測(cè) 細(xì)胞分組及給藥同1.4.3,取細(xì)胞培養(yǎng)上清后按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)上清中 TGF-β1及MMP-9含量。

    1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA水平 RAW264.7細(xì)胞以1×109L-1接種于6孔板,每孔1 mL。細(xì)胞分組及給藥同1.4.3,細(xì)胞培養(yǎng)24 h后每孔細(xì)胞加入1 mL trizol提取試劑提取細(xì)胞總RNA,按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書操作合成cDNA,采用SYBR GreenI嵌合熒光法于熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增,以小鼠β-actin基因?yàn)閮?nèi)參對(duì)照。反應(yīng)體系為:SYBR Premix Ex TaqⅡ12.5 μL ,Primer F 1 μL,Primer R 1 μL,cDNA 2μL,ddH2O 8.5 μL 擴(kuò)增條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,62℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行復(fù)孔,并重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取平均值。用2-ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)基因庫(kù)中基因序列設(shè)計(jì)TGF-β1、MMP-9基因及內(nèi)參基因β-actin引物,各基因引物序列見(jiàn)表1。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。均值間差異比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況 三七總皂苷在10~300 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞增殖情況與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,900 μg/mL和2700 μg/mL細(xì)胞增殖情況與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見(jiàn)表2。提示三七總皂苷在10~300 μg/mL范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用,可在此劑量范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    表1 Q-PCR引物序列

    表2 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況(±s)

    表2 各組RAW264.7細(xì)胞增殖情況(±s)

    注:①與正常對(duì)照組比較,P<0.01。

    組別 n 濃度/(μg/mL) OD值正常對(duì)照組31.598 ±0.232三七總皂苷組 3103010030090027001.554 ±0.0951.588 ±0.0251.661 ±0.2971.720 ±0.1040.866 ±0.094①0.361 ±0.016①地塞米松組31001.528 ±0.077

    2.2 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況 LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。三七總皂苷100,300 μg/mL組和地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著低于LPS組(P均<0.01)。見(jiàn)表3。

    表3 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況(±s)

    表3 各組RAW264.7細(xì)胞NO釋放情況(±s)

    注:①與正常對(duì)照組比較,P <0.01;②與 LPS組比較,P <0.01。

    組別 n 濃度/(μg/mL) NO/(μmol/mL)正常對(duì)照組36.530 ±0.505 LPS 組 3117.116 ±0.532①LPS+三七總皂苷組 3103010030017.859 ±0.74516.610 ±0.37314.695 ±0.475②12.937 ±0.339②LPS+地塞米松組 310013.607 ±0.612①

    2.3 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF-β1、MMP-9分泌情況 LPS組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1、MMP-9含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。LPS+三七總皂苷100,300 μg/mL組及LPS+地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中TGF-β1含量顯著低于LPS組(P均<0.05);LPS+三七總皂苷300 μg/mL組、LPS+地塞米松組細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-9含量顯著低于 LPS組(P<0.01或P<0.05)。見(jiàn)表4。

    2.4 各組RAW264.7細(xì)胞TGF-β1mRNA、MMP-9mRNA表達(dá)情況 檢測(cè)所提取樣本總 RNA A260/A280在1.8~2.0,RNA較純,無(wú)蛋白質(zhì)污染,內(nèi)參及目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)大于0.99,擴(kuò)增效率90%~120%,內(nèi)參及目的基因溶解曲線峰形單一,擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較好。Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,LPS組中TGF-β1mRNA、MMP-9 mRNA的表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)。LPS+三七總皂苷300 μg/mL組、LPS+地塞米松組MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯低于 LPS組(P均 <0.05);LPS+三七總皂苷100,300 μg/mL組及LPS+地塞米松組TGF-β1mRNA表達(dá)量明顯低于LPS組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表5。

    表4 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF-β1、MMP-9分泌情況(±s)

    表4 各組RAW264.7細(xì)胞上清中TGF-β1、MMP-9分泌情況(±s)

    注:①與正常對(duì)照組比較,P<0.05;②與正常對(duì)照組比較,P<0.01;③與 LPS組比較,P <0.05;④與 LPS組比較,P <0.01。

    組別 n 濃度/(μg/mL) TGF-β1/(ng/mL) MMP-9/(ng/mL)正常對(duì)照組322.539±0.55112.809±0.861 LPS組 3130.971±1.292① 17.165±0.941②LPS+三七總皂苷組 3103010030025.961±0.39826.889±0.67623.371±0.423③22.656±0.531③16.072±1.22615.756±0.49515.187±1.01512.594±0.754④LPS+地塞米松組 310020.697±1.852③ 13.192±1.261③

    表5 各組RAW264.7細(xì)胞TGF-β1mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)情況(±s)

    表5 各組RAW264.7細(xì)胞TGF-β1mRNA、MMP-9 mRNA表達(dá)情況(±s)

    注:①與正常對(duì)照組比較,P<0.05;②與 LPS組比較,P<0.05;③與 LPS組比較,P <0.01。

    組別 n 濃度/(μg/mL) TGF-β1mRNA MMP-9 mRNA正常對(duì)照組31.001.00 LPS組 311.90±0.073① 2.59 ±0.319①LPS+三七總皂苷組 310301003001.52±0.2101.45 ±0.2551.31±0.164②0.95 ±0.4961.95 ±0.0892.09 ±0.2032.06 ±0.4391.47 ±0.090②LPS+地塞米松組 31000.99±0.179③ 1.56±0.095②

    3 討論

    巨噬細(xì)胞的激活是炎癥反應(yīng)的重要環(huán)節(jié),LPS等激活巨噬細(xì)胞后在酶的催化下合成過(guò)量的NO[9],可介導(dǎo)并放大炎癥反應(yīng),促進(jìn)肺組織的炎性滲出及肺泡的損傷。研究報(bào)道COPD患者NO的生成及釋放增多,測(cè)定NO升高可提示存在氣道炎癥[10]。巨噬細(xì)胞激活后分泌過(guò)高的MMP-9對(duì)炎性細(xì)胞有趨化作用,可促進(jìn)炎癥發(fā)展,更為重要的是MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì),使肺泡結(jié)構(gòu)破壞,參與COPD氣道重建過(guò)程,導(dǎo)致氣流阻塞。對(duì)COPD動(dòng)物模型及COPD患者的研究表明,其體內(nèi)肺組織、血液中MMP-9表達(dá)水平均升高[11-12]。此外巨噬細(xì)胞分泌的TGF-β1是氣道重建的主要調(diào)控因子[13],其表達(dá)增高,可引起氣道上皮細(xì)胞損傷,誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,肌成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的膠原合成活性,故促進(jìn)氣道膠原沉積和基底膜增厚,促進(jìn)結(jié)締組織蛋白合成[14-16],在氣道重建中發(fā)揮重要作用,最終可導(dǎo)致氣道狹窄和不可逆的肺功能改變。因此,能拮抗巨噬細(xì)胞分泌NO、MMP-9、TGF-β1的藥物可能減輕氣道炎癥反應(yīng),延緩氣道重建過(guò)程,減緩COPD的發(fā)病。

    本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)三七總皂苷在10~300 μg/mL范圍內(nèi)未對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯毒性作用;未經(jīng)LPS刺激的正常對(duì)照組NO、MMP-9、TGF-β1分泌較少,且 MMP-9、TGF-β1mRNA 表達(dá)較低,加入 LPS刺激后,NO、MMP-9、TGF-β1釋放量顯著增加,MMP-9、TGF-β1mRNA表達(dá)亦上調(diào),表明LPS能夠誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞過(guò)度激活,釋放炎癥相關(guān)遞質(zhì)。經(jīng)三七總皂苷干預(yù)后,三七總皂苷100 μg/mL組和300 μg/mL組與 LPS組相比,NO、MMP -9、TGF - β1含量均降低 ,MMP-9、TGF-β1mRNA表達(dá)亦明顯下調(diào),提示三七總皂苷能夠從細(xì)胞水平和轉(zhuǎn)錄水平上抑制 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌的功能。

    綜上所述,三七總皂苷可能是通過(guò)下調(diào) NO、TGF-β1、MMP-9的表達(dá)抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥反應(yīng),從而推測(cè)此途徑可能是其臨床治療COPD獲效的作用機(jī)制之一,而要明確三七總皂苷治療COPD的分子調(diào)控體系、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需進(jìn)一步深入研究,這也是今后積極研究的方向。

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    三七總皂苷膠束狀態(tài)與超濾分離的相關(guān)性
    中成藥(2017年8期)2017-11-22 03:18:44
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    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:34
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    3種陰離子交換色譜固定相捕獲細(xì)胞培養(yǎng)上清液中紅細(xì)胞生成素的效果比較
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    采用PCR和細(xì)胞培養(yǎng)方法比較流感樣病例不同標(biāo)本的流感病毒檢出觀察
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