小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能實驗的改進(jìn)*

周會芳，徐 倩，邊育紅，劉曉輝，李 丹

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，天津 300193）

吞噬實驗是微生物學(xué)與免疫學(xué)實驗教學(xué)中的經(jīng)典實驗，實驗?zāi)康闹饕糜谟^察機體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等吞噬外來異物的能力，從而反映機體的天然免疫防御功能[1-3]。吞噬細(xì)胞是一類能吞噬、清除病原體的重要效應(yīng)細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞。中性粒細(xì)胞又稱小吞噬細(xì)胞，大吞噬細(xì)胞則是存在于組織中的巨噬細(xì)胞和血液中的大單核細(xì)胞[4-5]。

大吞噬實驗是通過觀察巨噬細(xì)胞對異物顆粒（如鴿子紅細(xì)胞[6]、雞紅細(xì)胞[7-8]、熒光顆粒[9-11]、魚紅細(xì)胞等[12]）的吞噬能力，來評價吞噬細(xì)胞的功能和反映非特異性免疫應(yīng)答能力[13-14]。傳統(tǒng)的大吞噬實驗中多采用鴿子紅細(xì)胞或者雞紅細(xì)胞作為吞噬顆粒腹腔注射到小鼠體內(nèi)，通過對腹腔液進(jìn)行涂片、Giemsa染色觀察體內(nèi)的巨噬細(xì)胞對鴿子紅細(xì)胞或者雞紅細(xì)胞的吞噬現(xiàn)象來反映巨噬細(xì)胞的吞噬功能[6,15]。染色后的雞紅細(xì)胞具有個體大呈梭型，并且核著色清楚等優(yōu)點，本教研室對免疫學(xué)中的大吞噬實驗一直采用這種傳統(tǒng)的方法來進(jìn)行，但是近幾年發(fā)現(xiàn)這個實驗過程中也存在一些缺點，比如購買雞或者鴿子的流程不方便和雞紅細(xì)胞或鴿子紅細(xì)胞制備比較麻煩等，使得每次實驗課需要花費一半的時間在紅細(xì)胞的制備上，讓學(xué)生在實驗課上把握不好時間，很大的降低了學(xué)習(xí)效率，更重要的是前幾年高校中致病性禽流感的發(fā)生[16-18]，致使禽類動物在本科教學(xué)實驗中的使用受到很大的限制，為了避免實驗過程中的不安全因素，并結(jié)合學(xué)校對醫(yī)學(xué)免疫學(xué)大吞噬實驗課的教學(xué)安排和相應(yīng)的儀器設(shè)備，急需在原有的實驗基礎(chǔ)上對實驗中存在的不安全因素做一些改革來適應(yīng)新的實驗教學(xué)計劃。本實驗根據(jù)以往的實驗課教學(xué)經(jīng)驗和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，用3%硫代乙醇酸鈉溶液激活腹腔巨噬細(xì)胞，將吞噬顆粒雞紅細(xì)胞換成酵母菌，分別比較巨噬細(xì)胞體內(nèi)對雞紅細(xì)胞和酵母菌的吞噬功能（包括吞噬百分率和吞噬指數(shù)），為改進(jìn)醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中大吞噬實驗的方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物：健康昆明白雄性小鼠，體質(zhì)量18~22 g，由天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，顆粒飼料喂養(yǎng)。

主要試劑和儀器：硫代乙醇酸鈉購自上海谷研實業(yè)有限公司，酵母粉購自上海根生生物科技有限公司，胰蛋白胨和瓊脂粉購自北京三藥科技開發(fā)公司，枸櫞酸鈉和氯化鈉購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，酵母菌購自中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，吉姆薩染料購自南京建成生物工程研究所，甲醇均由天津市光復(fù)試劑研究所提供，0.9%氯化鈉注射液由石家莊四藥有限公司提供，一次性無菌注射器等耗材均為山東瑞通高分子醫(yī)療器械有限公司，光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯，離心機為湖南湘儀離心機儀器有限公司，恒溫培養(yǎng)箱為廣東省醫(yī)療器械廠。

1.2 3%硫代乙醇酸鈉的制備 稱取硫代乙醇酸鈉3 g，溶于100 mL的0.9%氯化鈉注射液中，121℃高壓滅菌20 min，放4℃冰箱備用。

1.3 3.8%枸櫞酸鈉溶液的制備 稱取枸櫞酸鈉3.8 g，溶于100 mL的0.9%氯化鈉注射液中，121℃高壓滅菌20 min，放4℃冰箱備用。

1.4 5%雞紅細(xì)胞懸液制備 用濕棉花擦拭雞翅膀根部，拔掉羽毛，用乙醇棉球擦拭，使血管充盈，用含1/10抽血比例的枸櫞酸鈉溶液的一次性10 mL注射器從遠(yuǎn)心端進(jìn)針，抽取雞翅膀血5 mL，分裝到10 mL容量的圓底離心管中，經(jīng)1 500 r/min，10 min，棄去上液和紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再加入10倍以上血量的0.9%氯化鈉注射液，上下顛倒輕輕混勻，再次離心棄去上清液，重復(fù)離心3次直至上清液透明無血色，按紅細(xì)胞壓積用0.9%氯化鈉注射液配置5%的雞紅細(xì)胞懸液，放4℃冰箱備用[7,19]。

1.5 LB（Luria－Bertani）斜面培養(yǎng)基的制備 將胰蛋白胨 1 g，酵母粉 0.5 g，氯化鈉 1 g，瓊脂粉 2 g，加入蒸餾水至100 mL，調(diào)整pH值7.0后分裝至15 mL的瓶口試管中，用牛皮紙包好，121℃高壓滅菌20 min，取出后將培養(yǎng)基趁熱做成斜面，斜面長度占試管總長度的1/2，凝固后若試管內(nèi)有冷凝水，放在37℃左右的培養(yǎng)箱內(nèi)烘去冷凝水，放4℃冰箱備用。

1.6 酵母菌菌液的制備 用接種環(huán)將酵母菌接種到LB斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，每支培養(yǎng)基中加0.5 mL的0.9%氯化鈉注射液反復(fù)吹打沖洗斜面培養(yǎng)物上的酵母菌，收集酵母菌液，參照麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)比濁管，將酵母菌液用0.9%氯化鈉注射液調(diào)至濃度為1×109cfu/ml[20]，放4℃冰箱備用。

1.7 吞噬實驗 將小鼠隨機分成3組，每組9只。第1組為空白對照組，第2組雞紅細(xì)胞組，第3組酵母菌組，每只小鼠經(jīng)腹腔注射3%硫代乙醇酸鈉溶液3 mL，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生腹腔巨噬細(xì)胞。96 h后，第1組空白對照組每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.6 mL，第2組雞紅細(xì)胞組每只小鼠經(jīng)腹腔注射雞紅細(xì)胞懸液0.6 mL，第3組酵母菌組每只小鼠經(jīng)腹腔注射酵母菌0.6 mL，全部注射后輕柔腹部。注射10、30、60 min后，取對照組、雞紅細(xì)胞組和酵母菌組各3只小鼠，頸椎脫臼處死，腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2 mL，輕輕按摩腹部后，消毒腹部皮膚后剪開腹中部皮膚一小口，用毛細(xì)吸管取出每組小鼠腹腔液，將每組每只小鼠取腹腔液滴于3張玻片，用另一張玻片推片，自然干燥后丙酮-甲醇溶液固定5 min。將固定好的玻片滴加Giemsa染液10 min后，自來水沖干凈，在顯微鏡油鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體內(nèi)吞噬雞紅細(xì)胞和酵母菌的現(xiàn)象，并計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率：每100個吞噬細(xì)胞中吞有雞紅細(xì)胞或酵母菌的吞噬細(xì)胞數(shù)。吞噬指數(shù)：將100個吞噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞或酵母菌的總數(shù)除以100。

2 實驗結(jié)果

將做好的玻片標(biāo)本放在油鏡下，空白對照組中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞形態(tài)輪廓清晰，形狀呈圓形或橢圓形，形態(tài)典型，見圖1a。巨噬細(xì)胞吞噬酵母菌數(shù)量較多，且吞噬的酵母菌數(shù)從一個到幾個不等，還有部分酵母菌黏附在巨噬細(xì)胞外圍，見圖1b。而巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)較少,且視野中雞紅細(xì)胞和小鼠紅細(xì)胞不易區(qū)分，見圖1c。

圖1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬酵母菌和雞紅細(xì)胞

小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和酵母菌的吞噬百分率差不多，但是從小鼠巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞和酵母菌的吞噬指數(shù)可以看出，巨噬細(xì)胞對酵母菌的吞噬數(shù)量比吞噬雞紅細(xì)胞數(shù)量大，說明巨噬細(xì)胞對酵母菌的吞噬能力更強。見表1。

表1 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞和酵母菌的吞噬百分率

3 討論

大吞噬實驗是重要的免疫學(xué)實驗，里面涉及到的實驗技能比較全面，包括實驗動物的正確捉拿方法、小鼠腹腔注射方法、細(xì)胞涂片染色方法、顯微鏡的使用等多項技能。因為本實驗的授課對象為大學(xué)2年級學(xué)生，初次接觸這種綜合性的實驗，因此明顯的實驗結(jié)果，簡單的操作步驟有助于學(xué)生掌握基本實驗技能，在此基礎(chǔ)上更好地加深對理論知識的理解與運用。

機體內(nèi)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等都具有吞噬功能，這些細(xì)胞的功能正常與否關(guān)系到免疫應(yīng)答的抗原提呈過程和抗原清除能力。在體內(nèi)激活的巨噬細(xì)胞能吞噬異物顆粒，包括鴿子紅細(xì)胞、雞紅細(xì)胞和酵母菌等，這其中酵母菌相對更安全，而且穩(wěn)定比較好，適合做大吞噬實驗中的吞噬顆粒[21-22]。

吞噬實驗中，采用Giemsa染色光學(xué)顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞對吞噬顆粒的吞噬現(xiàn)象，計算其吞噬百分率和吞噬指數(shù)來評價巨噬細(xì)胞的吞噬清除異物的能力[23]，吞噬指數(shù)越大，說明巨噬細(xì)胞對吞噬顆粒的吞噬能力越大。本實驗通過比較小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞和酵母菌的吞噬作用，發(fā)現(xiàn)注射吞噬物30 min后即出現(xiàn)吞噬現(xiàn)象，更方便學(xué)生對實驗課時間的把握。和吞噬雞紅細(xì)胞組相比，巨噬細(xì)胞對酵母菌的吞噬現(xiàn)象更明顯，通過比較其吞噬指數(shù)，說明巨噬細(xì)胞對酵母菌的吞噬能力更強。

本實驗中，將吞噬物雞紅細(xì)胞換成酵母菌，省去每組制作雞紅細(xì)胞懸液過程中采集雞血和多次離心的時間，有利于學(xué)生對實驗課時間的安排。一次保存的酵母菌可以用于多次巨噬細(xì)胞吞噬功能的實驗，并且能保證實驗穩(wěn)定性。酵母菌在體外進(jìn)行Giemsa染色后顏色明顯，和小鼠紅細(xì)胞等其他雜質(zhì)容易進(jìn)行區(qū)分，有利于學(xué)生進(jìn)行觀察和計數(shù)，有助于學(xué)生對巨噬細(xì)胞吞噬作用的理解和掌握。

可溶性淀粉、蛋白胨溶液等物質(zhì)可激活巨噬細(xì)胞，使其吞噬異物的能力加強，但也有實驗結(jié)果表明效果并不十分理想[24]。研究表明[25-26]，用硫代乙醇酸鈉溶液作為巨噬細(xì)胞的刺激劑，結(jié)果比較穩(wěn)定，提前4 d給小鼠腹腔注射3%的硫代乙醇酸鈉溶液激活巨噬細(xì)胞，使巨噬細(xì)胞大量游出，與傳統(tǒng)方法中使用淀粉溶液的方法更穩(wěn)定。為了適應(yīng)新的教學(xué)大綱，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)效率，需要不斷的努力探索，找到簡單而且高效的實驗方法，除了以上的這些改革，筆者計劃根據(jù)實驗和實驗條件的要求進(jìn)行體外大吞噬實驗，即將硫代乙醇酸鈉誘導(dǎo)的小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞取出，在體外進(jìn)行巨噬細(xì)胞吞噬酵母菌的實驗，直接為學(xué)生提供小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，這樣既不需要使用動物進(jìn)行實驗，更節(jié)省了時間，有利于開展新的免疫學(xué)實驗，又避免了小鼠腹腔內(nèi)其他雜細(xì)胞的干擾，影響吞噬現(xiàn)象的觀察。

本實驗結(jié)果顯示，小鼠巨噬細(xì)胞在體內(nèi)對酵母菌的吞噬能力比對雞紅細(xì)胞強，而且酵母菌容易獲得，重復(fù)性好，更無傳播疾病的危險，適合做大吞噬實驗中的吞噬顆粒。在改進(jìn)此實驗方法的基礎(chǔ)上，希望根據(jù)這個實驗進(jìn)一步設(shè)計出適合中醫(yī)藥專業(yè)的綜合性實驗，如：使用中藥后對吞噬細(xì)胞活性、吞噬功能及氧化損傷的影響[27-28]，或者引導(dǎo)學(xué)生自主設(shè)計相關(guān)實驗，篩選有促進(jìn)或者抑制吞噬細(xì)胞功能的中藥，對吞噬現(xiàn)象的機制進(jìn)行探討，同時也有利于學(xué)生對知識點的掌握程度，更加強學(xué)生對中藥在免疫學(xué)應(yīng)用中的理解，較大的激發(fā)學(xué)生的主動學(xué)習(xí)和創(chuàng)新能力。

綜上所述，大吞噬實驗中，用3%硫代乙醇酸鈉溶液激活巨噬細(xì)胞，并將吞噬物雞紅細(xì)胞換成酵母菌，能更好的觀察巨噬細(xì)胞對酵母菌的吞噬作用，并且結(jié)果判斷容易，操作方法簡單，可用于各類醫(yī)學(xué)院校的免疫實驗教學(xué)。

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