心復(fù)康聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心臟干細(xì)胞CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)的影響*

王一婧，曾文赟，李虎虎，魏 冰，闞伯紅，范英昌

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

在缺血應(yīng)激時(shí)，血管新生是維持組織血液供應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制，然而，機(jī)體自身代償?shù)难苄纬珊蛡?cè)支循環(huán)有限，無法滿足心肌對(duì)血供的需求。研究發(fā)現(xiàn)[1]，內(nèi)源性心臟干細(xì)胞（CSC）在一定條件下可分化為內(nèi)皮細(xì)胞，而心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞在促進(jìn)血管新生、建立側(cè)支循環(huán)、保護(hù)缺血心肌的過程中起著重要作用[2]。但是由于體內(nèi)CSC數(shù)量有限且分化力弱，其代償作用難以實(shí)現(xiàn)[3]，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖是血管新生的前提，故激活CSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化，成為促進(jìn)心肌微血管生成的基本環(huán)節(jié)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）是源于中胚層的早期細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能[4]，多年來引起越來越多研究者的關(guān)注，并在組織工程、細(xì)胞治療及器官移植等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[5]。然而近期研究發(fā)現(xiàn)，非心肌細(xì)胞具有自分泌和旁分泌功能，可產(chǎn)生某些可溶性物質(zhì)，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[6]，因此對(duì)BMSC的研究重點(diǎn)從促進(jìn)其定向分化轉(zhuǎn)為增強(qiáng)其旁分泌效應(yīng)。在心肌組織中，外源性BMSC可通過旁分泌作用干預(yù)內(nèi)源性CSC，促進(jìn)CSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化，但兩者的協(xié)同效應(yīng)受到心肌缺血微環(huán)境的制約。

本課題組前期研究表明，心復(fù)康的主要成分能夠促進(jìn)心肌梗死周邊區(qū)域的血管新生，從而改善該區(qū)域的血液供應(yīng)及微環(huán)境[7]。由此提出假說，心復(fù)康可介導(dǎo)BMSC動(dòng)員CSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并體外觀察其聯(lián)合BMSC對(duì)CSC的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31（CD31）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR2）蛋白表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)1～3 d C57BL/6J小鼠20只，雌雄不分。由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。

1.2 主要試劑 DMEM/F12、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（Gibco），胎牛血清（Hyclone），β-巰基乙醇、非必需氨基酸、胰蛋白酶及膠原酶Ⅳ（Sigma），乙二胺四乙酸二鈉、蛋白電泳相關(guān)試劑（上海生工），c-kit單克隆抗體、FITC標(biāo)記的二抗（BD），磷酸鹽緩沖液（PBS）、抗熒光淬滅封片劑（索萊寶），CD31及VEGFR2抗體（Abcam），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（Uscn），GAPDH 抗體、山羊抗兔/小鼠二抗（中杉金橋），4%多聚甲醛固定液（博士德）。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)（HITACHI，日本），二化碳（CO2）培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)），離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)），低溫高速離心機(jī)（Sigma，美國(guó)），流式細(xì)胞分選儀（BD，美國(guó)），酶標(biāo)儀（島津，日本），倒置相差光學(xué)顯微鏡、正置熒光顯微鏡（Leica，德國(guó)），電泳裝置（北京六一儀器廠，中國(guó)），濕性轉(zhuǎn)膜儀（GE，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Biorad，美國(guó)），恒溫振蕩箱（上海智誠(chéng)，中國(guó)）。

2 方法

2.1 BMSC培養(yǎng)及心復(fù)康含藥血清的制備 鑒定具體方法參見文獻(xiàn)[8]，心復(fù)康組成：西洋參15 g，白術(shù) 15 g，枸杞子 15 g，女貞子 10 g，鹿銜草 10 g，昆布10 g，降香 10 g。

2.2 心復(fù)康對(duì)BMSC分泌SDF-1α的影響 將第3代BMSC以1×105/mL的密度分3組接種于96孔板，每孔100 μL，24 h后（待細(xì)胞貼壁），以含不同血清（10%胎牛血清、10%對(duì)照血清、10%含藥血清）的DMEM處理3組細(xì)胞。72 h后收集各組條件培養(yǎng)液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照ELISA說明書測(cè)定其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）的濃度。

2.3 CSC的培養(yǎng)及鑒定

2.3.1 CSC原代培養(yǎng) 采用75%醫(yī)用乙醇予新生小鼠消毒，于超凈臺(tái)中剪下心臟，去除大血管蒂和心臟下1/3部分，以PBS沖洗血液至液體澄清，然后將組織剪成1~2 mm3的小塊。向組織塊加入2 mL混合消化液（含2.5 g/L胰酶和1 g/LⅣ型膠原酶），吹打30 s，置于37℃恒溫振蕩箱內(nèi)振蕩（每分鐘40次），5 min，棄上清。以上操作反復(fù)3次，以200目篩網(wǎng)過濾消化液，用CSC完全培養(yǎng)基（含15%胎牛血清，5 μg/L bFGF，1%非必需氨基酸，0.1 mmol/L β-巰基乙醇的DMEM/F12）沖洗組織塊。最后用顯微鑷將組織塊轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，加入1 mL全培（目的為保持組織塊濕潤(rùn)），置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，輕搖6孔板，觀察組織塊是否貼壁牢固，再加入1.5 mL全培繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3.2 流式細(xì)胞鑒定和分選 將原代細(xì)胞用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，以1 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。細(xì)胞密度調(diào)整為5×106~1×107/mL。采用生物素標(biāo)記的c-kit單克隆抗體與FITC標(biāo)記的抗生物素二抗，分別室溫孵育細(xì)胞2 h，一抗和二抗反應(yīng)結(jié)束后，PBS沖洗細(xì)胞3次，經(jīng)0.45 μm篩網(wǎng)過濾。將未做標(biāo)記的細(xì)胞作為空白對(duì)照（調(diào)節(jié)電壓），先進(jìn)行標(biāo)記率檢測(cè)，后作分選。將收集到的細(xì)胞用CSC全培培養(yǎng)，2~4 h后更換全培，每2~3 d換液1次。

2.3.3 細(xì)胞免疫熒光鑒定 貼壁的CSC用4%多聚甲醛固定15 min后，以封閉血清室溫孵育1 h，ckit一抗室溫孵育2 h，F(xiàn)ITC標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1 h，最后滴加抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像（注：固定及孵育后需用PBS洗3 遍，每遍 10 min）。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 包括對(duì)照組、心復(fù)康組及抑制劑組。將CSC全培重懸的CSC以1×105/mL的密度接種于Transwell小室內(nèi)（抑制劑組的CSC用含10 mg/L AMD3100的全培預(yù)孵育1 h），下室接種BMSC全培重懸的BMSC（密度同上）。24 h后，對(duì)照組下室換含10%對(duì)照血清的DMEM，心復(fù)康組、抑制劑組下室換含10%含藥血清的DMEM，各組小室內(nèi)仍換CSC全培，將細(xì)胞置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中，72 h后進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)的Western Blot分析 按照試劑說明書裂解細(xì)胞，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。以25 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉，一抗4℃孵育過夜。二抗室溫孵育，加入ECL發(fā)光液成像。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組CD31、VEGFR2與內(nèi)參灰度值之比值，作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所得結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)作圖采用Origin 8.0軟件。

3 結(jié)果

3.1 BMSC分泌SDF-1α的結(jié)果 通過標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算各組樣本中SDF-1α蛋白的濃度表明，BMSC具有分泌SDF-1α的能力，與胎牛血清（FBS）組和對(duì)照血清（Control）組相比，含藥血清（XFK）組 BMSC 分泌SDF-1α的能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖 1。

3.2 CSC培養(yǎng)結(jié)果 培養(yǎng)板中接種的組織塊約6 h大部分可貼壁，培養(yǎng)3 d后即有成纖維細(xì)胞和小而亮的CSC從組織塊中爬出，約14 d后大部分細(xì)胞已從組織塊中爬出。見圖2。

3.3 CSC流式細(xì)胞鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞鑒定結(jié)果顯示，c-kit陽性細(xì)胞所占比例在15%左右，將分選所得的c-kit陽性細(xì)胞反復(fù)收集，繼續(xù)培養(yǎng)，將收集的細(xì)胞增殖、傳代后繼續(xù)采用c-kit鑒定。見圖3。

圖1 各組SDF-1α的濃度

圖2 CSC原代培養(yǎng)圖片（×200）

圖3 組織塊培養(yǎng)法所得細(xì)胞分選前c-kit陽性標(biāo)記細(xì)胞情況

3.4 CSC免疫熒光鑒定結(jié)果 培養(yǎng)數(shù)代后以c-kit一抗進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)幾乎全部細(xì)胞上均有c-kit表達(dá)，表明該培養(yǎng)條件適合CSC生長(zhǎng)，細(xì)胞基因穩(wěn)定，其干細(xì)胞潛能仍保持不變。見圖4。

圖4 CSC免疫熒光鑒定（×200）

3.5 心復(fù)康聯(lián)合BMSC對(duì)CSC的CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)的影響 Western Blot結(jié)果提示，與對(duì)照組（C）和抑制劑組（XFK+AMD3100）相比，心復(fù)康組（XFK）CSC的CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

圖5 各組CSC的CD31和VEGFR2蛋白表達(dá)情況

4 討論

CSC 表面主要表達(dá) c-kit+、Sca-1+和 MDR1+，其中約65%的CSC同時(shí)表達(dá)上述3種抗原，約20%的CSC同時(shí)表達(dá)其中兩種抗原，約有15%的CSC只表達(dá)其中一種抗原[9]。干細(xì)胞表達(dá)的抗原不同，在生長(zhǎng)和分化方面的潛能也不同，體外實(shí)驗(yàn)表明，c-kit+細(xì)胞分化能力強(qiáng)于MDR1+、Sca-1+和c-kit+/MDR1+/Sca-1+細(xì)胞。同時(shí)，c-kit+細(xì)胞的表型穩(wěn)定，能在體外充分?jǐn)U增而不失去擴(kuò)增能力[10]。

SDF-1屬于CXC趨化因子超家族，SDF-1α最初從骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分離得到，廣泛表達(dá)于多種組織，主要的生物效應(yīng)是誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶和血管生成因子的趨化、黏附、運(yùn)動(dòng)及分泌作用[11]，同時(shí)可激活CSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化[12]，并刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成。SDF-1α/CXCR4信號(hào)途徑在血管形成和心臟發(fā)生中起基礎(chǔ)作用，如募集血管干/祖細(xì)胞，刺激血管生成因子的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移形成新血管等[13]。AMD3100為SDF-1α受體阻滯劑，用其預(yù)處理CSC，使共培養(yǎng)體系中BMSC分泌的SDF-1α不再發(fā)揮作用。

CD31存在于內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處，且常位于血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能與血管生成有關(guān)。

VEGF在胚胎血管發(fā)育、成體血管新生及血管通透性調(diào)節(jié)過程中是必不可少的[14]，主要通過與兩個(gè)受體酪氨酸激酶（VEGFR1和VEGFR2）結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用[15]。VEGFR1是VEGF的高親和力受體，與VEGF結(jié)合后競(jìng)爭(zhēng)性抑制VEGFR2活性，具有負(fù)調(diào)控作用[16]。而VEGFR2是實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管新生及血管通透性增加的最主要受體，結(jié)合VEGF的VEGFR2引起受體二聚化、激酶激活及酪氨酸殘基自身磷酸化[17]，調(diào)控下游基因表達(dá)，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞存活、增殖和遷移。研究表明，基因敲除VEGFR2可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞分化，導(dǎo)致胚胎早期死亡。因此，VEGFR是血管新生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，VEGF與其結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，在血管新生的過程中是不可或缺的。

西洋參莖葉總皂苷可促進(jìn)缺血心肌內(nèi)源性VEGF的合成與分泌，從而促進(jìn)心肌血管新生，血管密度增加，改善心肌微循環(huán)，具有保護(hù)心肌缺血性損傷的作用[18]。補(bǔ)腎中藥可誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，在心血管系統(tǒng)再生修復(fù)治療方面有積極作用。枸杞子、女貞子均屬于補(bǔ)腎中藥，對(duì)干細(xì)胞長(zhǎng)期生長(zhǎng)分化無毒，且利于分化后細(xì)胞活體移植[19]。鹿銜草總黃酮對(duì)擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加血管灌注液流量，增強(qiáng)心肌收縮力，抗心律失常等有明顯效應(yīng)[20]。絳香能促進(jìn)體外內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有促血管新生作用，不但促進(jìn)促血管新生因子的表達(dá)，而且降低血管抑素和內(nèi)皮抑素的表達(dá)，從而使血管生長(zhǎng)各因子的平衡向促進(jìn)血管新生的方向發(fā)展[21]。

本研究顯示，心復(fù)康協(xié)同BMSC能夠上調(diào)CSC中CD31和VEGFR2的蛋白表達(dá)，而AMD3100可顯著阻滯其上調(diào)作用。由此提示，心復(fù)康與BMSC協(xié)同具有促進(jìn)CSC向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能，而SDF-1α/CXCR4軸是其中的作用機(jī)制之一。

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