鞘內(nèi)注射布美他尼對(duì)大鼠急性疼痛行為及鈉鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)的影響

朱少飛，唐群新

鞘內(nèi)注射布美他尼對(duì)大鼠急性疼痛行為及鈉鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)的影響

朱少飛，唐群新

目的 探討鞘內(nèi)注射布美他尼對(duì)大鼠術(shù)后痛覺(jué)過(guò)敏形成的作用機(jī)制，為臨床研究及應(yīng)用提供理論參考。方法 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、注藥組、手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組。采用熱輻射法(熱痛敏)、von Frey細(xì)絲法(機(jī)械痛敏)及疼痛累計(jì)評(píng)分法(疼痛保護(hù)反應(yīng))觀察、記錄術(shù)前及術(shù)后2、4、6 h大鼠的行為學(xué)改變，采用免疫組化，熒光顯微鏡觀察各組術(shù)后2、4、6 h背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的NKCC1表達(dá)，并行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的熱痛閾均降低(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組熱痛閾明顯高于手術(shù)組(P<0.05)。注藥組大鼠在注藥后2 h的機(jī)械痛閾升高(P<0.05)，手術(shù)組大鼠的機(jī)械痛閾明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后疼痛累計(jì)評(píng)分均升高(P<0.05)，但手術(shù)組明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增多(P<0.01)；組間比較，實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯少于手術(shù)組(P<0.01)。結(jié)論 鞘內(nèi)注射布美他尼能提高切口痛模型大鼠的熱痛閾值及機(jī)械痛閾值，降低疼痛累計(jì)評(píng)分，減少切口痛模型大鼠DRG的NKCC1的表達(dá)，提示布美他尼對(duì)急性疼痛過(guò)敏的形成有抑制作用，其抗傷害作用可能與抑制NKCC1活動(dòng)有關(guān)。NKCC1對(duì)急性痛覺(jué)過(guò)敏形成與維持起重要作用。

布美他尼；鈉鉀氯聯(lián)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1；急性疼痛；痛閾

0 引言

手術(shù)創(chuàng)傷所致的痛覺(jué)過(guò)敏有別于各種致痛模型，包括典型的辣椒素致痛模型和福爾馬林致痛模型，術(shù)后疼痛通常伴隨有炎性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛[1-2]。既往的研究多集中在神經(jīng)炎性疼痛模型，對(duì)于急性創(chuàng)傷性疼痛形成及持續(xù)過(guò)程中NKCC1表達(dá)及作用如何，目前報(bào)道較少[3]。本研究擬通過(guò)建立大鼠切口痛模型，通過(guò)鞘內(nèi)注射N(xiāo)KCC1阻滯劑布美他尼(Bumetanide)，觀察其對(duì)大鼠疼痛行為學(xué)及NKCC1表達(dá)的影響，探討NKCC1在急性痛覺(jué)過(guò)敏形成過(guò)程的作用及可能機(jī)制，為以后臨床研究與治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與鞘內(nèi)注射方式 8～10周齡雄性SD大鼠135只，體重250～300 g，清潔級(jí)，由海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組(27只)：不做任何處理；注藥組(36只)：只鞘內(nèi)注藥；手術(shù)組(36只)：只行右足底切開(kāi)手術(shù)建立切口痛模型；實(shí)驗(yàn)組(36只)：先鞘內(nèi)注藥，后行右足底切開(kāi)手術(shù)建立切口痛模型。以人工腦脊液配制布美他尼(批號(hào)：B3023，Sigma Aldrich公司，美國(guó))藥液，濃度為5 μg/μL。方法如下：人工腦脊液配方：1.3 mmol CaCl22 H2O，2.6 mmol KCl,0.9 mmol MgCl2,21.0 mmol NaHCO3，2.5 mmol Na2HPO47 H2O,125.0 mmol NaCl及3.5 mmol葡萄糖，以95%二氧化碳+5%氧氣混合氣體吹灌至pH值7.2～7.4。鞘內(nèi)注藥方法：大鼠予1.4%七氟醚吸入麻醉后，予背部常規(guī)備皮消毒，穿刺點(diǎn)位于L4-5間隙，以26 G針頭破皮后，以30 G針頭在穿刺點(diǎn)穿刺，大鼠出現(xiàn)甩尾或蹬腿反應(yīng)提示穿刺成功后注入布美他尼溶液20 μL。

1.2 切口痛模型建立 在吸入1.4%七氟醚麻醉下，常規(guī)消毒大鼠右后爪，參照Scalbert等[4]方法，從足底近端0.5 cm處向足趾做1 cm切口，縱向切開(kāi)皮膚后，以眼科鑷子挑起足底肌肉并行縱向切割，但保持肌肉起止及附著完整。紗布按壓止血后用0號(hào)絲線縫合皮膚兩針，術(shù)畢用碘伏消毒切口并將大鼠置于溫暖、安靜、避強(qiáng)光的環(huán)境。

1.3 行為學(xué)觀察 每組隨機(jī)選取實(shí)驗(yàn)大鼠18只，建模前各組大鼠均先行環(huán)境適應(yīng)3～5 d，待大鼠完全適應(yīng)環(huán)境后，分別測(cè)定大鼠的熱痛閾、機(jī)械痛閾和疼痛累計(jì)評(píng)分的術(shù)前基礎(chǔ)值(n=6)。

1.4 熱痛閾測(cè)定 參照Hagreaves等[5]方法，采用熱刺痛儀測(cè)定各組大鼠的熱痛閾值。測(cè)定方法：將大鼠置于8 mm×8 mm金屬篩網(wǎng)上，四周以透明塑料盒環(huán)繞，采用熱刺痛儀(PL-200，中國(guó)成都泰盟公司)照射右足底傷口周?chē)?.5 mm范圍，不直接照射傷口，照射強(qiáng)度設(shè)置為30%，同一部位照射間隔5 min，連續(xù)照射3次，記錄從開(kāi)始照射到右足抬高的時(shí)間，取平均值為熱痛閾，單次照射不超過(guò)30 s，超過(guò)30 s者以30 s記錄。記錄術(shù)前、術(shù)后2、4、6 h各組大鼠的熱痛閾的測(cè)定值。

1.5 機(jī)械痛閾測(cè)定 參照Keith等[6]方法，采用von Frey細(xì)絲刺激法測(cè)定各組大鼠的機(jī)械痛閾。測(cè)量方法：各組大鼠均在術(shù)前先將大鼠置于8 mm×8 mm金屬篩網(wǎng)上，四周以透明塑料盒環(huán)繞，以不同折力(3.61，3.84，4.08，4.17，4.31，4.56，4.74，4.93，5.07，5.18，5.46，5.88 g)的von Frey細(xì)絲(Stoelting測(cè)痛包58011，美國(guó))刺激大鼠右足底切口周?chē)?.5 mm范圍內(nèi)的皮膚，不直接刺激傷口，出現(xiàn)抬足為陽(yáng)性反應(yīng)。測(cè)定首先從中等力度的von Frey纖維絲(4.56)開(kāi)始，當(dāng)該力度的von Frey纖維刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，則給予相鄰大一級(jí)力度的纖維刺激；如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行，直至出現(xiàn)第一次陽(yáng)性和陰性(或陰性和陽(yáng)性)反應(yīng)的騎跨，再向下連續(xù)測(cè)定4次。不同刺激之間相隔30 s，以消除前一刺激的影響。陽(yáng)性反應(yīng)記為“×”，陰性反應(yīng)記為“O”。記錄陽(yáng)性反應(yīng)組合，50%縮足閾值采用下列公式計(jì)算：50%縮足閾值(g)=10[Xf+kδ]。公式中Xf為初次應(yīng)用的von Frey纖維力度的log值，δ為相鄰von Frey纖維力度log值之間差值的平均值，k為陽(yáng)性反應(yīng)組合的查表值。記錄術(shù)前、術(shù)后2、4、6 h各組大鼠的機(jī)械痛閾的測(cè)定值。

1.6 疼痛累計(jì)評(píng)分 參照Z(yǔ)ahn等[7]方法，采用疼痛累計(jì)評(píng)分法評(píng)定大鼠術(shù)后保護(hù)性行為的改變。觀察方法：將大鼠置于8 mm×8 mm網(wǎng)格上，四周以透明塑料盒環(huán)繞，以大鼠右后足是否著地負(fù)重作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：后爪完全著地負(fù)重評(píng)為0分，后爪著地但不負(fù)重評(píng)為1分，后爪不著地評(píng)為2分。每次觀察時(shí)間為1 min，每隔5 min重復(fù)一次，連續(xù)觀察1 h，將每次分?jǐn)?shù)累加得出為疼痛累計(jì)評(píng)分。記錄術(shù)前、術(shù)后2、4、6 h各組大鼠的疼痛累計(jì)評(píng)分。

1.7 NKCC1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)測(cè)定 冰面上迅速分取右側(cè)腰段第五背根神經(jīng)節(jié)(DRG)，組織放入4%多聚甲醛4 ℃過(guò)夜，然后放入20%蔗糖溶液(0.01 mmol/L PBS配制)，充分沉底后在冰凍切片機(jī)(德國(guó)萊卡)連續(xù)額狀切片，切片厚度15 μm。將切片置于24孔板，每孔4～5張，以0.01 mmol/L的PBS洗片3次，每次5 mim，加入0.5%Triton室溫孵育45 min，以0.01 mmol/L的PBS洗片3次，每次5 min，再加入1%小牛血清蛋白室溫孵育25 min，以0.01 mmol/L的PBS洗片3次，每次5 min。滴加山羊抗NKCC1血清(SANTA CRUZ，sc-21545)，4 ℃孵育過(guò)夜，于室溫下復(fù)溫30 min后，以0.01 mmol/L的PBS洗片3次，每次5 min，滴加驢抗山羊熒光二抗(abcam，ab7004)，室溫孵育2 h，以0.01 mmol/L的PBS洗片3次，每次5 min，最后貼片，以抗淬滅甘油封片。每組取相同節(jié)段DRG切片3張，熒光顯微鏡下(400倍，一個(gè)視野)進(jìn)行NKCC1陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 熱痛閾的變化 各組基礎(chǔ)熱痛閾值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，注藥組大鼠在注藥后2、4 h的熱痛閾升高(P<0.05)，手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的熱痛閾均降低(P<0.05)；與手術(shù)組比較，實(shí)驗(yàn)組熱痛閾明顯高于手術(shù)組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)熱痛閾值比較(s)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與手術(shù)組比較，#P<0.05

2.2 機(jī)械痛閾的變化 各組基礎(chǔ)機(jī)械痛閾比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，注藥組大鼠在注藥后2 h的機(jī)械痛閾升高(P<0.05)，手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的機(jī)械痛閾均降低(P<0.05)，其中手術(shù)組大鼠的機(jī)械痛閾又明顯低于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 疼痛累計(jì)評(píng)分 注藥組與對(duì)照組各觀察時(shí)間點(diǎn)的疼痛累計(jì)評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組比較，手術(shù)組與實(shí)驗(yàn)組術(shù)后疼痛累計(jì)評(píng)分均升高(P<0.05)且手術(shù)組明顯高于實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)機(jī)械痛閾值比較(g)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與手術(shù)組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)疼痛累計(jì)評(píng)分的比較(中位數(shù)，四分位間距)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與手術(shù)組比較，#P<0.05

2.4 NKCC1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)的變化 與對(duì)照組比較，注藥組在各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯增多(P<0.01)；組間比較，實(shí)驗(yàn)組的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯少于手術(shù)組(P<0.01)，見(jiàn)表4、圖1。

表4 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較(個(gè))

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與手術(shù)組比較，#P<0.01

3 討論

術(shù)后疼痛是一種常見(jiàn)的機(jī)制獨(dú)特而復(fù)雜的疼痛模式，其形成機(jī)制和疼痛行為與化學(xué)炎癥疼痛和神經(jīng)病理性疼痛有所不同。以往在炎性疼痛模型及神經(jīng)病理疼痛模型中獲得的新發(fā)現(xiàn)對(duì)于指導(dǎo)術(shù)后疼痛治療有一定的局限。因此，本研究采用Brennan創(chuàng)立的切口痛模型，此模型大鼠的疼痛行為與臨床術(shù)后疼痛行為類(lèi)似，是最能模擬術(shù)后疼痛的動(dòng)物模型[8-9]。手術(shù)操作致組織損傷，手術(shù)部位局部缺血，可引起包括前列腺素、激肽、5-羥色胺、氫離子和鉀離子、P物質(zhì)、NO和其他一些細(xì)胞因子等疼痛性介質(zhì)產(chǎn)生、聚集；手術(shù)操作還會(huì)造成末梢神經(jīng)的切斷、壓迫或牽拉引起神經(jīng)源性疼痛[10-12]。組織損傷和持續(xù)的傷害性刺激會(huì)導(dǎo)致脊髓背角和其他中樞性痛覺(jué)傳導(dǎo)通路內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生興奮性改變，誘發(fā)中樞敏化。本實(shí)驗(yàn)觀察到手術(shù)組及實(shí)驗(yàn)組大鼠接受手術(shù)后均出現(xiàn)痛閾下降和對(duì)患足的保護(hù)行為改變，提示手術(shù)創(chuàng)傷能使中樞敏化產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射布美他尼能提高切口痛模型大鼠的熱痛閾與機(jī)械痛閾值，改善大鼠的疼痛行為學(xué)，降低疼痛累計(jì)評(píng)分，并且能減少切口痛模型大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)的NKCC1的表達(dá)，提示布美他尼對(duì)急性疼痛過(guò)敏的形成有抑制作用，其抗傷害作用可能與抑制NKCC1活動(dòng)有關(guān)。

圖1 背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞NKCC1的表達(dá)(免疫熒光，×400)

本實(shí)驗(yàn)觀察到注藥組大鼠與對(duì)照組比較有痛閾提高，提示NKCC1參與了痛覺(jué)信號(hào)的傳導(dǎo)。布美他尼是一種高效髓袢利尿劑，主要作用是抑制NKCC蛋白。其藥理作用到達(dá)峰值時(shí)間15～30 min，作用持續(xù)時(shí)間約為4 h。注藥組大鼠熱痛閾、機(jī)械痛閾分別于4 min和2 h后回復(fù)正常水平，與布美他尼作用時(shí)間相符，而熱痛和機(jī)械痛的不同步考慮與傳入神經(jīng)不同有關(guān)。而手術(shù)組和實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后均出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏，但實(shí)驗(yàn)組熱痛閾、機(jī)械痛閾較手術(shù)組高，提示布美他尼能明顯減輕大鼠急性創(chuàng)傷后早期疼痛程度。此外，實(shí)驗(yàn)組大鼠4 h后痛敏程度仍較手術(shù)組大鼠輕，考慮與布美他尼在術(shù)后早期抑制或減弱背根反射的形成有關(guān)[13]，此外，脊髓在術(shù)后抑制性氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放增多[14]，減弱疼痛信號(hào)傳入，起保護(hù)作用，也不排除其他內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)起作用。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為痛覺(jué)過(guò)敏形成機(jī)制與背根反射有關(guān)[15]，NKCC1通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度，參與背根反射形成[16]。在炎癥狀態(tài)下，各種原因?qū)е碌腘KCC1表達(dá)上調(diào)及(或者)活動(dòng)增強(qiáng)，導(dǎo)致初級(jí)傳入神經(jīng)元內(nèi)氯離子濃度增加，當(dāng)中間神經(jīng)元激活釋放GABA作用于GABA受體導(dǎo)致氯離子通道開(kāi)放時(shí)，由于胞內(nèi)氯離子濃度極大于包膜外，導(dǎo)致氯離子大量外流，使PAD被擴(kuò)大，導(dǎo)致初級(jí)傳入神經(jīng)元過(guò)度去極化形成逆行性動(dòng)作電位向外周傳導(dǎo)，這一過(guò)程稱(chēng)為“背根反射”(Dorsal root reflexes，DRRs)。

NKCC1除表達(dá)上調(diào)以外，主要通過(guò)磷酸化及通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上兩條途徑活化。磷酸化是NKCC1介導(dǎo)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。NKCC1蛋白位于胞漿的N-端，是磷酸化的作用位點(diǎn)[17]，而磷酸化的結(jié)果是NKCC1活化更多的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)[18-22]。除磷酸化以外，蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)也參與NKCC1的調(diào)節(jié)，這一活化形式緣于對(duì)NKCC2的研究[23-24]。本實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)設(shè)在2、4、6 h，因此，主要觀察背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元NKCC1陽(yáng)性表達(dá)，基本不涉及磷酸化改變。在背根神經(jīng)節(jié)切片的免疫熒光檢測(cè)中，手術(shù)組切片陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，提示手術(shù)操作致組織損傷能促使DRG的NKCC1表達(dá)上調(diào)。在實(shí)驗(yàn)組切片陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)也較對(duì)照組明顯增多，但明顯少于手術(shù)組，提示應(yīng)用布美他尼后減少了NKCC1在細(xì)胞膜上表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)觀察到NKCC1表達(dá)減少，考慮由于布美他尼抑制NKCC1活動(dòng)，減弱了背根反射及痛覺(jué)過(guò)敏的形成，繼而減弱了一些目前還不完全明確的上調(diào)NKCC1表達(dá)的刺激因素，導(dǎo)致NKCC1表達(dá)減少。因而布美他尼的抗傷害作用與減少NKCC1的活動(dòng)有關(guān)，NKCC1表達(dá)減少或許為NKCC1活動(dòng)減少的繼發(fā)表現(xiàn)。

綜上所述，本研究表明鞘內(nèi)注射布美他尼能提高切口痛模型大鼠的熱痛閾與機(jī)械痛閾值，改善大鼠的疼痛行為學(xué)，降低疼痛累計(jì)評(píng)分，并且能減少切口痛模型大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)的NKCC1的表達(dá)并產(chǎn)生抗傷害作用。如果在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)能阻斷NKCC1上調(diào)或者活化的發(fā)生，必將成為痛覺(jué)過(guò)敏治療的藥理學(xué)新靶點(diǎn)。

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Effects of intrathecal injection of bumetanide on acute pain behavior and expression of Na+-K+-2Cl-cotransport 1 in rats

ZHU Shao-fei,TANG Qun-xin

(Department of Anesthesiology,Haikou People′s Hospital,Haikou 570208,China)

Objective To explore the mechanism of intrathecal injection of bumetanide in rats which formed action of postoperative hyperalgesia,and provide theoretical reference for clinical research and application.Methods The rats were randomly divided into control group,drug injection group,surgery group and experimental group.The rats behavior changes were observed and recorded by thermal radiation(heat pain sensitivity),von Frey filament method(mechanical pain sensitivity) and cumulative pain score(pain reaction) before and at 2,4,6 h after operation.The rats dorsal root ganglion(DRG) expression of NKCC1 at 2,4,6 h after operation was detected by immunohistochemistry,and positive cells were counted.Results Thermal pain threshold of surgical group and experimental group decreased at all time points(P<0.05),and experimental group was significantly higher than that of surgical group(P<0.05).Mechanical pain threshold of drug injection group increased in 2 h after drug infusion(P<0.05),but the scores of mechanical pain threshold of surgery group was significantly lower than that of experimental group(P<0.05).Postoperative pain scores of surgical group and experimental group increased cumulatively(P<0.05),but surgery group was obviously higher than that of experimental group(P<0.05).Positive cell count of surgical group and experimental group significantly increased at all time points(P<0.01),the positive cell count of experimental group was significant lower than that of surgical group(P<0.01).Conclusion Intrathecal injection of bumetanide can improve the incision pain model rats, thermal pain threshold and mechanical pain threshold,reduce cumulative pain score,and the DRG expression of NKCC1,it could inhibit the allergic to acute pain,and the effect may be related to the inhibition of NKCC1 activities.NKCC1 plays an important role in the formation and maintenance of acute hyperalgesia.

Bumetanide；Na+-K+-2Cl-cotransport 1；Acute pain；Pain threshold

2014-07-30

海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院麻醉科，?？?570208

10.14053/j.cnki.ppcr.201503007