溫度敏感性水凝膠攜帶阿利吉侖對心肌梗死后大鼠左室重構(gòu)的影響

劉 楊，李曉艷，蔣學(xué)俊，陳盼盼，李 君，賀 偉

溫度敏感性水凝膠攜帶阿利吉侖對心肌梗死后大鼠左室重構(gòu)的影響

劉 楊，李曉艷*，蔣學(xué)俊，陳盼盼，李 君，賀 偉

目的 探討水凝膠攜帶腎素抑制劑阿利吉侖對心肌梗死后大鼠心室重構(gòu)的影響。方法 70只Wistar大鼠隨機分成5組：假手術(shù)組(Sham組，0只)、磷酸緩沖液組(Pbs組，15只)、磷酸緩沖液+阿利吉侖組(Pbs+a組，15只)、水凝膠組(Gel組,15只)和水凝膠+阿利吉侖組(Gel+a組，15只)，后4組大鼠分別在心梗模型制作成功后，于心肌梗死區(qū)周邊注射等體積的磷酸緩沖液、含有1.5 mg阿利吉侖的磷酸緩沖液、1.5%的溫度敏感性水凝膠和含有1.5 mg阿利吉侖的1.5%溫度敏感性水凝膠；而假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎，心肌梗死4周后，用病理切片方法統(tǒng)計心梗面積和膠原容積分?jǐn)?shù)；Western blot的方法檢測心肌梗死后心肌組織中MMP-2、MMP-9、TIMP、TGF-β的蛋白含量。結(jié)果 心肌梗死4周后，56只大鼠存活，其中Sham組8只、Pbs組11只、Pbs+a組12只、Gel組12只、Gel+a組13只；Gel+a組的心梗面積和膠原容積分?jǐn)?shù)明顯低于Pbs組(P<0.01)；心肌組織中MMP-2、MMP-9、TGF-β的蛋白含量明顯低于Pbs組(P<0.05)；而心肌組織中TIMP的含量明顯高于Pbs組(P<0.05)；Gel+a組這些作用被進一步增強。結(jié)論 溫度敏感性水凝膠攜帶阿利吉侖比單純應(yīng)用水凝膠更能改善心肌梗死后大鼠的心室重構(gòu)，具有協(xié)同的心肌保護作用。其可能機制是通過影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1的活性及下調(diào)TGF-β的表達來影響膠原代謝，減少膠原的合成來改善心室重構(gòu)及心肌梗死后的心功能。

阿利吉侖；溫度敏感性水凝膠；心肌梗死；心室重構(gòu)

0 引言

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)激活，RAAS激活后介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細胞增生、纖維化，調(diào)節(jié)活性物質(zhì)的基因表達，激活多樣細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，均與心肌梗死后心臟組織修復(fù)及重構(gòu)有關(guān)[1-2]。RAAS包括全身RAAS和局部RAAS，實驗證明抑制RAAS后能顯著改善心肌纖維化[3]。阿利吉侖最早于2007年由美國FDA批準(zhǔn)上市，其主要是通過直接抑制腎素，從而抑制血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ，來抑制RAS系統(tǒng)。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，阿利吉侖可顯著改善心肌梗死后大鼠的改善心室重構(gòu)[4-6]。

葡聚糖-聚己內(nèi)酯-甲基丙烯酸羥乙酯共聚N-異丙基丙烯酰胺[Dextran-poly(e-caprolactone)-hydroxylethyl methacrylate/poly(N-isopropylacrylamide)，Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm]水凝膠是一種人工合成的可降解的溫度敏感性生物材料。這種新型的高分子材料具有良好的生物相容性，前期試驗證明了這種溫度敏感性水凝膠注入體內(nèi)后不具有生物毒性[7]。這種溫度敏感性水凝膠在4 ℃時為液態(tài)，37 ℃時為固態(tài)，因此，該水凝膠可直接注入靶組織并在溫度迅速升高的誘導(dǎo)下瞬時局部成膠[7]。利用水凝膠的局部濃度高、緩釋、無毒的特點，可提高阿利吉侖在局部心肌組織內(nèi)的濃度。加上水凝膠本身對心肌梗死后的心室重構(gòu)有抑制作用，可增加阿利吉侖對心肌梗死后的心肌組織的保護作用。本研究證實，可降解溫度敏感型Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝膠攜帶阿利吉侖注射于心肌梗死周邊區(qū)，能取得更好的心臟保護作用。

1 實驗方法和材料

1.1 實驗動物 70只4周齡雄性大鼠，平均體重160～180 g，購自武漢大學(xué)實驗動物中心，分籠飼養(yǎng)。

1.2 實驗藥物 阿利吉侖購自大連美侖公司，水凝膠由武漢大學(xué)高分子實驗室提供；基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1(Tissue inhibitor metalloproteinase,TIMPs)抗體購自santa公司；轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)抗體購自abcam公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物有限公司。

1.3 心梗模型的建立 將70只大鼠隨機分成5組：假手術(shù)組(Sham組)、模型對照組(磷酸緩沖液組即Pbs組)、水凝膠組(Gel組)、Pbs攜帶阿利吉侖組(Pbs+a組)、溫度敏感型水凝膠攜帶阿利吉侖組(Gel+a組)，各組經(jīng)腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(20 mg/kg)麻醉后，氣管插管，正中開胸，暴露心臟后，在左前降支(LAD)近端穿線并結(jié)扎，Ⅱ?qū)?lián)出現(xiàn)ST段和(或)T波抬高或降低、結(jié)扎線以下心肌顏色變暗為結(jié)扎成功。其中假手術(shù)組只將縫線穿過冠狀動脈不結(jié)扎,其余各組在結(jié)扎成功后，分別在梗死周邊區(qū)的4個點注入以下藥物，Pbs組：注射75 μL Pbs溶液；Gel組：注射濃度為1.5%的75 μL水凝膠；Pbs+a組：注射75 μL含有1.5 mg阿利吉侖的Pbs溶液；Gel+a組：注射含有1.5 mg阿利吉侖的濃度為1.5%75 μL水凝膠。術(shù)后注射3 d青霉素(50萬IU/d)預(yù)防感染。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 注射過量戊巴比妥鈉(200 mg/kg)處死實驗鼠，隨后取出心臟，并用肝素化生理鹽水灌洗心臟并分離左心室，每個心臟的一部分用4%多聚甲醛固定48 h，用石蠟包埋，在梗死部位垂直于長軸橫向進行心臟切片，厚度4 μm，每個樣本在不同層面取3張切片作為代表。行HE染色、改良Masson三色染色，顯微鏡下觀察梗死部位左心室的形態(tài)及水凝膠殘余情況。采用Image Pro Plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件測量梗死區(qū)面積，并計算梗死百分比。梗死百分比=梗死面積/左室總面積×100%。

應(yīng)用Image Pro Plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件系統(tǒng)拍照，通過灰度調(diào)節(jié)區(qū)分膠原和非膠原成分，Masson染色組織中藍色為陽性膠原。并進行分析測定，計算心肌膠原含量百分比，即膠原容積分?jǐn)?shù)(Collagen volume fraction，CVF：心肌膠原面積/所測同視野組織總面積，每張切片隨機選取10個不重復(fù)的視野，取平均值)。

大鼠處死后取心肌梗死周邊區(qū)的組織，提取組織蛋白后，采用 SDS-PAGE 電泳分析MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TGF-β蛋白的表達。

2 結(jié)果

70只大鼠用于本實驗，手術(shù)過程中死亡7只，造模成功后存活56只，其中假手術(shù)組8只，Pbs組、Gel組、Pbs+a組各存活11、12、12只，Gel+a組13只。手術(shù)前后各組間相比，大鼠體重未見明顯差異(表1)。

表1 各組大鼠體重變化(g)

2.1 心肌梗死面積分析 用Image Pro Plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件分析心肌梗死后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，Pbs組、Gel組、Pbs+a組、Gel+a組的心梗面積明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與Pbs組比較，Gel組、Gel+a組的梗死面積明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示注射Gel及Gel攜帶阿利吉侖的治療，有利于改善心肌重構(gòu)，而Pbs+a組與Pbs組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.72)，由于藥物在體內(nèi)無法達到有效的濃度；與單純Gel組比較，Gel+a組的心梗面積明顯減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(見表2、圖1)。

圖1 各實驗組心臟大體觀

表2 各組心肌梗死大鼠梗死面積百分比(%)

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Pbs組比較，#P<0.01；與Gel組比較，△P<0.01

2.2 膠原容積分?jǐn)?shù)分析 Masson染色后的心肌組織膠原部分為藍色，正常心肌組織顯紅色，顯微鏡下觀察，假手術(shù)組無膠原增生，心肌細胞及膠原排列整齊，其余各組均可見明顯膠原增生、斷裂，排列紊亂(圖2)。用Image Pro Plus 6.0多媒體彩色病理圖像分析軟件分析膠原容積分?jǐn)?shù)后發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，Pbs組、Gel組、Pbs+a組、Gel+a組的CVF明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Gel組、Gel+a組較Pbs組CVF明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；提示Gel及Gel攜帶阿利吉侖的治療有減少膠原沉積的作用；而Pbs+a組與Pbs比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.76)，Pbs不具有緩釋的作用，所以阿利吉侖在體內(nèi)無法達到有效的藥物濃度，無法起到治療作用；與單純Gel組比較，Gel+a組的CVF下降更加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)，說明水凝膠攜帶阿利吉侖能夠更好地抑制膠原的沉積。

圖2 各實驗組高倍鏡下膠原病理圖

表3 各組心肌梗死大鼠膠原容積分?jǐn)?shù)(%)

注：與Sham組比較，*P<0.05；與Pbs組比較，#P<0.05；與Gel組比較，△P<0.05

2.3 Western blot檢測蛋白的表達 與假手術(shù)組比較，Pbs組、Gel組、Pbs+a組、Gel+a組的 MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表達明顯升高(P<0.05)，TIMP-1蛋白水平降低。與Pbs組比較，Gel組、Gel+a組的MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表達明顯降低(P<0.05)，TIMP-1的表達較Pbs組明顯升高，而Pbs+a組與Pbs組相比，各蛋白表達無明顯差異(P=0.723)，Gel+a組與單純Gel組比較，MMP-2、MMP-9、TGF-β蛋白的表達明顯降低，而TIMP-1蛋白的表達升高(表4、圖3、圖4)。

表4 蛋白含量統(tǒng)計表

注：與Sham組比較，*P<0.01；與Pbs組比較，#P<0.01；與Gel組比較，△P<0.05，△△P<0.01

圖3 各組蛋白含量

圖4 各組蛋白含量條形圖

3 討論

心肌梗死發(fā)生以后，伴隨一系列復(fù)雜的病理生理變化，包括心肌細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞以及細胞外基質(zhì)的變化，梗死部位的疤痕修復(fù)，心肌間質(zhì)的纖維化，導(dǎo)致左室腔的大小、厚度和形態(tài)發(fā)生改變，這些改變總稱為左室重構(gòu)(Ventricular remodeling，VR)[8]。心室重構(gòu)不但影響心肌梗死后急性期的心功能狀態(tài)，而且是決定急性心肌梗死后心臟事件發(fā)生率和遠期預(yù)后的主要因素[8]。 膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，約占細胞外基質(zhì)的85%。心肌膠原網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的主要功能是為心肌細胞提供支持框架，維持心室的幾何形態(tài)，決定心室順應(yīng)性。間質(zhì)膠原正常情況下處于合成與降解動態(tài)平衡，隨著年齡的增長，膠原合成多于降解，膠原沉積增加；在某些病理狀態(tài)下，如MI、高血壓、心肌炎、心肌病等，心肌膠原分泌增加，但膠原纖維間連接減少，而繼發(fā)心力衰竭時膠原纖維在心肌細胞間過多地累積，即發(fā)生替代性纖維化，膠原和纖連蛋白等ECM組分增加，心肌僵硬性增加，順應(yīng)性降低，收縮和舒張功能障礙[9-11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，各個實驗組與Sham組比較，心肌梗死面積和膠原容積百分比均明顯升高，說明各實驗組心肌均發(fā)生了心室重構(gòu)。其中Gel組與Pbs組比較，心梗面積和膠原容積百分比均明顯減小，提示在梗死周邊區(qū)注射水凝膠可以抑制心肌梗死后心室重構(gòu)，這與以前的研究結(jié)果一致[7-12]。而與單純注射水凝膠比較，注射水凝膠與阿利吉侖的混合物能進一步降低心肌梗死面積，提示復(fù)合物對心室重構(gòu)的抑制作用更加明顯。

基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases，MMPs)由巨噬細胞分泌，其主要作用是降解細胞外基質(zhì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大概有20多種，而其中與心室重構(gòu)關(guān)系密切的是MMP-2和MMP-9。Peterson等[13]研究證實了在心肌梗死大鼠心肌組織中MMP-2和MMP-9的含量和活性增高；MMP-2和MMP-9能降解膠原和基底膜成分，導(dǎo)致心肌膠原網(wǎng)絡(luò)的重構(gòu)。運用慢性左心室衰竭的動物模型實驗發(fā)現(xiàn)：隨著左室擴大和功能障礙的發(fā)展，心肌MMPs的表達水平呈時間依賴性增加，同時伴有細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和成分的改變[14-16]，在心衰的代償期，MMP-2和MMP-9活性和含量降低，但隨著病情的進展，在心衰的失代償期，MMP-2和MMP-9活性和含量呈現(xiàn)增高的趨勢。

本實驗也證實，與Sham組比較，MMP-2和MMP-9的蛋白表達升高，與既往的研究結(jié)果一致；而與Pbs組比較，干預(yù)組Gel組和Gel+a組的MMP-2和MMP-9的含量明顯降低，提示Gel及Gel+a可以抑制心梗大鼠的MMP-2和MMP-9的過表達，與單純的Gel組比較，Gel+a組的MMP-2和MMP-9的含量降低更加明顯，這也提示水凝膠攜帶阿利吉侖能夠通過抑制MMP-2和MMP-9的表達來改善心肌重構(gòu)。

MMPs的內(nèi)源抑制物主要是TIMPs。MMPs的過度激活能導(dǎo)致MMPs/TIMP比例失調(diào)，而MMPs/TIMP比例失衡是導(dǎo)致心室重構(gòu)和心肌纖維化的重要原因。在人體內(nèi)TIMPs主要有4種，其中TIMP-1能抑制包括MMP-2及MMP-9在內(nèi)的大多數(shù)MMPs。既往研究發(fā)現(xiàn)，心衰患者的MMP-2、MMP-9明顯升高，TIMP-1則降低，膠原代謝活躍，但是給予相關(guān)的抗心衰藥物治療后，隨著MMP-2、MMP-9的相應(yīng)下降及TIMP-1的升高，心室重構(gòu)及心功能也得到改善[17-18]。

本研究中也證實了與Sham組相比，各實驗組的TIMP-1降低，而與Pbs組比較，Gel組和Gel+a組的TIMP-1明顯升高；而Gel組和Gel+a組比較，后者心肌組織中TIMP-1含量升高更明顯，提示水凝膠攜帶阿利吉侖能通過調(diào)節(jié)MMPs/TIMP的比例平衡而改善心肌梗死后心室重構(gòu)的作用。

轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)具有雙向的作用，一方面對心臟有保護作用；另一方面，TGF-β可以促進內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的增殖，提高心肌組織內(nèi)纖維粘連蛋白和膠原的表達，降低Ca2+及Mg2+依賴性ATP酶的活性和表達，導(dǎo)致心肌細胞的低分化和纖維組織的大量增生，因此，與心肌纖維化和心室重構(gòu)的病理過程密切相關(guān)[19-20]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在各個實驗組，TGF-β明顯升高，這也證明了各實驗組存在明顯的心室重構(gòu)。但與Pbs組比較，Gel組和Gel+a組的TGF-β明顯下降；Gel組與Gel+a組相比，Gel+a組的TGF-β下降更加明顯；水凝膠攜帶阿利吉侖能通過抑制TGF-β的過表達來抑制心室重構(gòu)。

目前，隨著醛固酮拮抗劑、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑、血管緊張素受體拮抗劑等藥物已廣泛應(yīng)用于臨床以改善心室重構(gòu)，其局限性逐漸凸顯出來。大量的研究表明，在血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素受體拮抗劑應(yīng)用過程中，會出現(xiàn)血漿醛固酮水平在短期內(nèi)下降，長期治療后仍然增高，即醛固酮逃逸現(xiàn)象[21]。所以現(xiàn)在很多的研究者關(guān)注RAAS系統(tǒng)的限速酶-腎素。近年來最引人注目的腎素抑制劑為阿利吉侖，其主要是通過抑制腎素，從而抑制血管緊張素原轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅰ來抑制RAS系統(tǒng)。在動物實驗中，阿利吉侖通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶的表達，從而顯著改善心肌梗死后大鼠的心室重構(gòu)[4,22]。溫度敏感性水凝膠的機械強度與心肌相似,注射后可增加心室壁厚度和增強室壁機械強度，防止梗死區(qū)擴展、心室擴大、室壁瘤形成,并減少矛盾運動,從而延緩心室重構(gòu)，改善心功能[23-25]。此外，Dex-PCL-HEMA/PNIPAAm水凝膠在體內(nèi)能緩慢降解，通過其緩釋作用，能延長阿利吉侖的作用時間，從而能取得更好的心肌保護作用。

本實驗證實了在心臟局部注射水凝膠及阿利吉侖復(fù)合物能夠抑制膠原的生成，而其機制主要是通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶和轉(zhuǎn)化生長因子的過表達以及上調(diào)金屬蛋白抑制劑的表達來改善心肌纖維化，從而達到抑制心室重構(gòu)的目的。

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Effects of aliskren with thermosensitive hydrogel on rat ventricular remodeling after myocardial infarction

LIU Yang,LI Xiao-yan*,JIANG Xue-jun,CHEN Pan-pan,LI Jun,HE Wei

(Department of Cardiology，Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430000,China)

Objective To investigate the effects of aliskren with thermosensitive hydrogel on rat ventricular remodeling after myocardial infarction.Methods Seventy male Wistar rats were randomly divided into five groups,Sham group(n=10),phosphate buffer solution group(Pbs group,n=15),phosphate buffer solution with aliskren group(Pbs+a group,n=15),thermosensitive hydrogel group(Gel group,n=15),thermosensitive hydrogel with aliskren group(Gel+a group,n=15),the four groups(Pbs gourp,Pbs+a gourp,Gel group,Gel+a group)were respectively injected 75 μL phosphate buffer solution,75 μL phosphate buffer solution with aliskren,75 μL thermosensitive hydrogel and 75 μL thermosensitive hydrogel with aliskren into the infarct area of rats after myocardial infarction.Four weeks later,the infarction area percentage and collagen volume fraction after separation of the heart were calculated.Protein expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TGF-β were determined by Western blotting.Results There were 56 rats survived after myocardial infarction:Sham group，n=8;Pbs group,n=11;Pbs+a group,n=12;gel group,n=12;Gel+a group,n=13.The infarction area percentage and the collagen volume fraction was significantly lower in Gel+a group than Pbs group(P<0.01).Compared with the Pbs group,the protein expression of MMP-2,MMP-9,TGF-β were higher in Gel+a group(P<0.05),and the protein expression of TIMP was lower than Pbs group.Conclusion Aliskren with thermosensitive hydrogel can improve ventricular remodeling and cardiac function by regulating down the expression of MMP-2,MMP-9,TGF-β and regulating up TIMP-1 after myocardial infarction.

Aliskren;Thermosensitive hydrogel;Myocardial infarction;Ventricular remodeling

2014-07-23

武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430000

國家自然科學(xué)基金(81170307)

10.14053/j.cnki.ppcr.201501005

*通信作者