BNIP3在心肌梗死GK糖尿病大鼠中的表達(dá)及氯化鈷對(duì)心肌細(xì)胞的影響

王聿杰 齊國(guó)先 鄭曉偉

BNIP3在心肌梗死GK糖尿病大鼠中的表達(dá)及氯化鈷對(duì)心肌細(xì)胞的影響

王聿杰 齊國(guó)先 鄭曉偉

目的 通過(guò)制作糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心肌梗死模型,研究BNIP3在糖尿病大鼠心肌梗死中的表達(dá),探討慢性氯化鈷處理對(duì)糖尿病大鼠血糖及心肌細(xì)胞凋亡的影響。 方法 應(yīng)用體質(zhì)量200～250g的雄性GK(Goto-kakizaki)糖尿病大鼠及其對(duì)照雄性Wistar大鼠,通過(guò)開(kāi)胸手術(shù)結(jié)扎麻醉大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作大鼠在體心肌梗死模型,心肌梗死模型制作前測(cè)量血糖,手術(shù)成功后分組喂養(yǎng)大鼠3周。3周后,測(cè)量血糖,剪取心臟,檢測(cè)缺血壞死區(qū)BNIP3的表達(dá)。 結(jié)果 與GK假手術(shù)組及心肌梗死組相比,GK心肌梗死+氯化鈷處理組血糖降低;與GK心肌梗死組相比,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3基因表達(dá)減少;與Wistar假手術(shù)組及Wistar心肌梗死組相比,Wistar心肌梗死+氯化鈷組血糖未見(jiàn)明顯變化，與Wistar心肌梗死組相比，Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白及基因表達(dá)亦無(wú)明顯變化。 結(jié)論 慢性氯化鈷處理降低糖尿病大鼠血糖,減少BNIP3凋亡基因在缺血壞死區(qū)的表達(dá),表明高血糖可能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡,降低血糖可以減少心肌細(xì)胞凋亡。

BNIP3; 糖尿病大鼠; 心肌梗死; 心肌細(xì)胞凋亡

2型糖尿病是冠心病最常見(jiàn)的合并癥之一。研究表明,冠心病合并糖尿病或者心肌梗死后發(fā)生應(yīng)激性高血糖癥患者病情嚴(yán)重程度增加,且愈后不佳[1]，其機(jī)制成為臨床研究的熱點(diǎn)。多項(xiàng)研究都證明高葡萄糖會(huì)誘發(fā)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡。本試驗(yàn)通過(guò)制作糖尿病大鼠和非糖尿病大鼠心肌梗死模型,研究BNIP3在糖尿病大鼠心肌梗死中的表達(dá),探討慢性氯化鈷處理對(duì)糖尿病大鼠血糖及心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 Wistar大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,Goto-kakizaki(GK)糖尿病大鼠購(gòu)自上海斯萊特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,抗BNIP3抗體(武漢博士德公司),Trizol 試劑(Ivitrogen公司),氯化鈷(Sigma公司)。

1.2 心肌梗死模型的制備 應(yīng)用體質(zhì)量在200～250 g的雄性GK糖尿病大鼠及其對(duì)照雄性Wistar大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。心肌梗死模型制作前測(cè)量血糖。通過(guò)開(kāi)胸手術(shù)結(jié)扎麻醉大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支制作大鼠在體心肌梗死模型。手術(shù)成功后分組飼養(yǎng)大鼠3周。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 實(shí)驗(yàn)分組:Wistar假手術(shù)組,Wistar心肌梗死組, Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組,GK假手術(shù)組, GK心肌梗死組, GK心肌梗死+氯化鈷處理組,每組動(dòng)物至少存活6只。Wistar和GK假手術(shù)組經(jīng)歷手術(shù)過(guò)程,但只掛線(xiàn)不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,心肌梗死組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,心肌梗死+氯化鈷處理組,于術(shù)前2 d開(kāi)始飲用1.5 mmol/L氯化鈷的水,術(shù)后給予飲用含2 mmol/L氯化鈷的水,每組動(dòng)物均不限制飲食。分組喂養(yǎng)3周時(shí),測(cè)量血糖,活體剪取心臟,生理鹽水沖洗后,每組中2個(gè)心臟凍存于-70 ℃冰箱中,留待生化檢測(cè),另4個(gè)心臟存于4%多聚甲醛溶液中固定,沿左室長(zhǎng)軸由心底至心尖做厚切片(結(jié)扎左前降支的心肌梗死組,由結(jié)扎處至心尖做厚切片),石蠟包埋切片。

1.4 血糖的測(cè)定 術(shù)前及術(shù)后3周血糖的測(cè)定均采用同一方法:10%的水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠后,用眼科剪斷尾采血,應(yīng)用美國(guó)強(qiáng)生血糖儀(SureStep Plus,LifeScan)及配用的血糖試紙測(cè)量血糖。

1.5 Western blot檢測(cè) 提取心肌總蛋白并調(diào)至同一濃度水平后聚丙烯酰胺凝膠電泳(每孔加樣20 μl)、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入BNIP3 (19 kD)和β-actin (42 kD)一抗(兔抗鼠多克隆抗體,均1∶200稀釋),4 ℃孵育過(guò)夜、洗膜,加入二抗(兔IgG 1∶400)孵育1 h,自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶平均積分光密度(IOD),將各個(gè)蛋白IOD分別與內(nèi)參β-actin IOD比值作為相應(yīng)蛋白半定量指標(biāo)。

1.6 RT-PCR檢測(cè) 采用 Trizol試劑一步法提取心肌細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定純度并定量。根據(jù)GenBank提供的BNIP3和內(nèi)參照β-actin 的mRNA序列,應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)引物,序列見(jiàn)表1。應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析,BNIP3基因的表達(dá)值以BNIP3吸光度值/β-actin吸光度值×100%表示。每個(gè)樣品的RT-PCR反應(yīng)至少重復(fù)3次。

表1 應(yīng)用于RT-PCR引物

PCR反應(yīng)條件:94 ℃、5 min,1個(gè)循環(huán);94 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、1 min,35個(gè)循環(huán); 72 ℃、5 min后結(jié)束擴(kuò)增反應(yīng)。取5 μl PCR產(chǎn)物與2 μl Lodding Buffer 混合,進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳,100 V 1.5 h,電泳結(jié)束后凝膠成像儀分析。

2 結(jié)果

2.1 血糖比較 術(shù)前Wistar大鼠各組之間血糖無(wú)差異,GK糖尿病大鼠各組之間血糖亦無(wú)差異,但Wistar大鼠和GK糖尿病大鼠之間比較血糖差異明顯(P<0.01)。在Wistar大鼠中,術(shù)前與術(shù)后3周相比,血糖值無(wú)差異。在GK糖尿病大鼠中,假手術(shù)組與心肌梗死組血糖術(shù)前與術(shù)后3周無(wú)變化,而在GK心肌梗死+氯化鈷處理組,術(shù)前與術(shù)后3周血糖變化明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 術(shù)前及術(shù)后3周各組血糖的比較

注:與相同處理方法Wistar組比較,**P<0.01;與術(shù)前比較,△△P<0.01

2.2 BNIP3蛋白表達(dá) 在Wistar大鼠中,與Wistar假手術(shù)組相比,Wistar心肌梗死組及Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。但Wistar心肌梗死組與Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組相比BNIP蛋白表達(dá)無(wú)差異(P=0.812)。而在GK糖尿病大鼠中,與GK假手術(shù)組相比,GK心肌梗死組及GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白表達(dá)增加(P<0.01),并且與GK心肌梗死組比較,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3蛋白表達(dá)減少 (P=0.02)。與Wistar心肌梗死組相比,GK心肌梗死組BNIP3 蛋白表達(dá)增加 (P=0.008)。見(jiàn)圖1及表3。

注：1. Wistar假手術(shù)組;2. Wistar心肌梗死組;3. Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組;4. GK假手術(shù)組;5. GK心肌梗死組;6. GK心肌梗死+氯化鈷處理組

2.3 BNIP3 mRNA表達(dá) 在Wistar大鼠中,與Wistar假手術(shù)組相比,Wistar心肌梗死組及Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。但Wistar心肌梗死組與Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組相比BNIP3 mRNA表達(dá)無(wú)差異(P=0.726)。而在GK糖尿病大鼠中,與GK假手術(shù)組相比,GK心肌梗死組及GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達(dá)增加(P<0.01),并且與GK心肌梗死組比較,GK心肌梗死+氯化鈷處理組BNIP3 mRNA表達(dá)減少,二者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)。GK心肌梗死組與Wistar心肌梗死組相比,GK心肌梗死組BNIP3 mRNA表達(dá)增加,二者之間差異顯著(P=0.006)。見(jiàn)圖2及表3。

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,在心肌梗死早期,細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞死亡的主要形式,細(xì)胞壞死跟隨在細(xì)胞凋亡之后,凋亡在早期心室重構(gòu)中起重要作用。而在心肌梗死后期,仍然有心肌細(xì)胞凋亡存在,且與進(jìn)行性心室重構(gòu)、心力衰竭密切相關(guān)[2-3]。

注：1. Wistar假手術(shù)組;2. Wistar心肌梗死組;3. Wistar心肌梗死+氯化鈷處理組;4. GK假手術(shù)組;5. GK心肌梗死組;6. GK心肌梗死+氯化鈷處理組

注:與假手術(shù)組比較,**P<0.01;與相同處理方法Wistar組比較,△△P<0.01;與心肌梗死組比較,▲P<0.05

高血糖是糖尿病的一個(gè)主要的病理因素,高血糖引起靜脈、動(dòng)脈和外周神經(jīng)的各種病理改變。在培養(yǎng)的牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,高血糖引起損傷的病理機(jī)制涉及:葡萄糖誘導(dǎo)的蛋白激酶C亞型的激活,葡萄糖衍生的高等糖化終產(chǎn)物(AGEs)生成增加,通過(guò)醛糖還原酶通路葡萄糖流出增加[4]。高血糖增加活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生,而ROS的產(chǎn)生增加可以被電子傳遞鏈復(fù)合體Ⅱ、氧化磷酸化解偶聯(lián)劑、解偶聯(lián)蛋白-1和二氧化錳超氧化物歧化酶阻斷,線(xiàn)粒體ROS恢復(fù)正常水平阻止葡萄糖誘導(dǎo)的蛋白激酶C亞型的激活A(yù)GEs生成、山梨(糖)醇積聚和核因子-κB(NF-κB)激活[5]。越來(lái)越多的證據(jù)表明線(xiàn)粒體電子傳遞鏈過(guò)氧化物的過(guò)多產(chǎn)生可能在糖尿病合并癥的病理機(jī)制中起著主要和關(guān)鍵的作用[5-6]。

鈷作為體內(nèi)的一個(gè)微量元素,在元素周期表中屬于ⅧB(niǎo)族。多項(xiàng)研究表明氯化鈷處理可以降低糖尿病大鼠血糖[7],其可能的機(jī)制有多種:氯化鈷可以引起STZ糖尿病大鼠GLUT1表達(dá)增加[8],增強(qiáng)大鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)[9],抑制糖原異生作用[10],恢復(fù)STZ 糖尿病大鼠肝糖原水平而對(duì)肌糖原沒(méi)有影響[11]，氯化鈷降低STZ 糖尿病大鼠肝臟、心臟和大動(dòng)脈的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示:氯化鈷降低糖尿病大鼠血糖,而不降低非糖尿病大鼠血糖,考慮的機(jī)制可能與降低高血糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)以及增加胰島素敏感性有關(guān)。

BNIP3是一個(gè)缺氧誘導(dǎo)的凋亡調(diào)節(jié)蛋白,由缺氧誘導(dǎo)因子1(hypo inducible factor 1, HIF-1)誘導(dǎo)表達(dá)[14-15]。HIF-1α可通過(guò)增加一些促凋亡蛋白的表達(dá),介導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族中的多個(gè)調(diào)節(jié)蛋白如Bak和Bax等都在HIF-1介導(dǎo)的凋亡中發(fā)揮作用。BNIP3是屬于Bcl-2家族BH3-only結(jié)構(gòu)域亞家族的一個(gè)線(xiàn)粒體促凋亡蛋白,可因缺氧或HIF-1α過(guò)表達(dá)而激活[16]。正常情況下BNIP3在大多數(shù)組織檢測(cè)不到,在多種細(xì)胞缺氧可強(qiáng)烈誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)[17-19]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GK糖尿病大鼠及其對(duì)照Wistar大鼠在心肌梗死后,其缺血壞死區(qū)BNIP3表達(dá)均增加,說(shuō)明缺氧可以誘發(fā)和加重心肌細(xì)胞凋亡,而慢性氯化鈷處理可以降低GK糖尿病大鼠血糖,同時(shí)降低BNIP3在缺血壞死區(qū)的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明冠心病合并糖尿病的病人,積極控制血糖對(duì)于缺血心肌可以起到積極的調(diào)節(jié)和保護(hù)作用,可以改善病情及預(yù)后,這有助于改善心功能并降低心肌梗死的死亡率。

總之,通過(guò)慢性氯化鈷處理降低糖尿病大鼠血糖,可能減輕高血糖引起的缺氧心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)和增加缺氧心肌對(duì)胰島素的敏感性,并減少BNIP3凋亡基因在GK糖尿病大鼠心肌缺血壞死區(qū)的表達(dá),可以改善心臟功能,并改善預(yù)后和降低心肌梗死的死亡率,為冠心病合并糖尿病患者積極控制血糖提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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Expression of BNIP3 and effect of cobalt chloride in GK diabetic rats with myocardial infarction

WANGYu-jie.DepartmentⅡofVeteranOfficers’Wards,GeneralHospitalofShenyangMilitaryAreaCommand,PLA,Shenyang110015,China;QIGuo-xian,ZHENGXiao-wei.CardiovascularDepartmentofFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110001,China.

Objective To investigate the expression of BNIP3 gene in GK diabetic rats with myocardial infarction, and to explore the effect of chronic treatment of cobalt chloride on blood glucose and cardiomyocytes apoptosis in myocardial infarction models of diabetic rats and non-diabetic rats. Methods The experiments were carried out in male GK(Goto-kakizaki) diabetic rats and male Wistar rats (both weighing 200-250 g). Left anterior descending coronary artery (LADCA) was ligated with silk ligature in anesthetized rats. Rats were divided into six groups and raised with different treatments for 3 weeks. Before and 3 weeks after operation, the level of blood glucose of each rat was measured. Three weeks after operation, the hearts of the rats were excised, then BNIP3 expression was detected in all groups. Results Compared with GK sham-operated group and GK operated group, the level of blood glucose of GK operated group treated with cobalt chloride decreased; Compared with GK operated group, BNIP3 expression in GK operated group treated with cobalt chloride decreased; Compared with Wistar sham-operated group and Wistar operated group, blood glucose didn’t significantly change in Wistar operated group treated with cobalt chloride; Compared with Wistar operated group, BNIP 3 expression didn’t change in Wistar operated group treated with cobalt chloride. Conclusions Chronic treatment with cobalt chloride can decrease the level of blood glucose in GK diabetic rats, and also decrease BNIP3 expression in ischemic zone and necrosis of GK diabetic rats, which indicate high blood glucose may promote cardiomyocytes apoptosis, and decreasing high blood glucose can decrease cardiomyocytes apoptosis.

BNIP3; diabetic rats;myocardial infarction; cardiomyocytes apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(30500212)

110015遼寧省沈陽(yáng)市，中國(guó)人民解放軍沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院第二干部病房(王聿杰); 110001遼寧省沈陽(yáng)市，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科(齊國(guó)先，鄭曉偉)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.07.010

2014-10-20)