立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯侵染過程的顯微結(jié)構(gòu)觀察與胞壁降解酶活性的測(cè)定

拓寧,張君,邱慧珍*,張文明,張春紅,劉星,朱靜

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

?

立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯侵染過程的顯微結(jié)構(gòu)觀察與胞壁降解酶活性的測(cè)定

拓寧1，2,張君1，2,邱慧珍1，2*,張文明1，2,張春紅1，2,劉星1，2,朱靜1，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

由立枯絲核菌引起的馬鈴薯莖潰瘍病(黑痣病)已成為限制甘肅省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要土傳病害之一。本研究在盆栽試驗(yàn)條件下將病原菌接種于馬鈴薯植株的莖基部，顯微觀察侵染過程，并測(cè)定了胞壁降解酶活性的變化。結(jié)果表明,土壤中接種病原菌后，馬鈴薯侵染順序依次為：芽-莖-根-匍匐莖-塊莖；接菌12 h后菌絲開始附著寄主表面，36 h后形成附著胞，48 h后形成侵染墊；電鏡下可見，細(xì)胞壁變形、斷裂，細(xì)胞膜破損，質(zhì)體結(jié)構(gòu)變形，細(xì)胞質(zhì)溶解和質(zhì)壁分離等；纖維素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的活性高達(dá)1.7，2.9和3.1 μg/(h·g)，顯著高于對(duì)照，尤其是PG和PMG的活性，為對(duì)照的兩倍。這些酶活性的提高可能與組織壞死有關(guān)。

立枯絲核菌；侵染過程；超微結(jié)構(gòu)；透射電鏡；胞壁降解酶

馬鈴薯(Solanumtuberosum)是位居小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)之后的第四大糧食作物[1]，近年種植面積和產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)，已成為調(diào)整中國(guó)種植業(yè)結(jié)構(gòu)和農(nóng)民增收的主要糧食作物之一[2]。甘肅省以其獨(dú)特的土壤和氣候特點(diǎn)成為我國(guó)重要的馬鈴薯種薯和商品薯基地以及淀粉加工基地，馬鈴薯生產(chǎn)已成為帶動(dòng)全省農(nóng)業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展，促進(jìn)農(nóng)業(yè)增效，農(nóng)民增收的戰(zhàn)略性主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)，在保障我省糧食安全和主產(chǎn)區(qū)農(nóng)民收入方面發(fā)揮著十分重要的作用[3-6]。而近年來馬鈴薯真菌病害的普遍發(fā)生，已成為馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因子[4-5,7-8]，尤其是由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起的馬鈴薯莖潰瘍病，發(fā)病日趨嚴(yán)重，對(duì)馬鈴薯塊莖產(chǎn)量、商品價(jià)值和馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了極大影響[9-11]。因此，探明馬鈴薯立枯絲核菌的致病機(jī)理對(duì)病害的有效防控具有十分重要的意義。

由立枯絲核菌引起的馬鈴薯莖潰瘍病(又稱莖基腐病、黑痣病、絲核菌潰瘍病和黑色粗皮病)是一種真菌性病害，以帶病種薯和土壤為主要傳播途徑[12-13]。主要危害幼芽、莖基部、匍匐莖和薯塊[14-17]。田間發(fā)病的馬鈴薯植株最直觀的癥狀表現(xiàn)為莖潰瘍和莖基部隘縮，感病植株的塊莖表現(xiàn)黑痣。由于立枯絲核菌可侵染馬鈴薯不同部位引起多種癥狀，病理和生理機(jī)制可能非常復(fù)雜，所以已有的研究主要集中在立枯絲核菌融合群鑒定[7]、生物學(xué)特性[18]以及病害的防治技術(shù)等方面[19-20]，而對(duì)病原菌致病機(jī)理的研究鮮有報(bào)道。

水稻立枯絲核菌的研究指出，胞壁降解酶的產(chǎn)生是水稻立枯絲核病菌重要的致病因子之一，人工培養(yǎng)產(chǎn)生的胞壁降解酶能引起水稻葉鞘細(xì)胞膜透性改變和組織浸解，可損傷組織結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞壁斷裂，細(xì)胞器變形等，在病斑形成和擴(kuò)展中起重要作用[21-22]。另有研究指出，果膠酶是水稻立枯絲核菌的致病因子，病菌產(chǎn)生果膠酶和纖維素酶的量與致病性密切相關(guān)[23]。

為此，我們通過接種病原菌，利用透射電鏡技術(shù)，結(jié)合植株形態(tài)組織學(xué)研究的方法，觀察立枯絲核菌侵染馬鈴薯芽和莖等器官的發(fā)病進(jìn)程和侵染結(jié)構(gòu)的形成過程以及立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯莖基部組織和細(xì)胞的破壞作用，同時(shí)測(cè)定莖基部組織胞壁降解酶的活性，旨在探明馬鈴薯立枯絲核菌可能的致病機(jī)理，以及病原菌胞壁降解酶的產(chǎn)生與寄主植物的組織和細(xì)胞遭受破壞作用之間的關(guān)系，為馬鈴薯莖潰瘍病的防控提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽試驗(yàn)于2014年4-9月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)室進(jìn)行，設(shè)2個(gè)處理：對(duì)照，空白不接菌的PDB培養(yǎng)基；處理，接入病原菌的PDB培養(yǎng)基，將病原菌按0.5 g/kg的量均勻拌入滅菌土壤中。采用20 cm×25 cm陶土盆，每盆裝土9 kg，每盆種植4株，每處理種20盆，共80次重復(fù)。

供試品種：馬鈴薯“大西洋”，由甘肅省景泰縣條山農(nóng)場(chǎng)提供；供試菌株：馬鈴薯立枯絲核菌(R.solani)-JT18，由本課題組提供。供試土壤：采自景泰條山農(nóng)場(chǎng)。

1.2病原菌和供試土壤的準(zhǔn)備

將立枯絲核菌菌餅(直徑9 mm)接種于PDB培養(yǎng)基中，于25℃ 黑暗培養(yǎng)3 d，用無菌紗布過濾菌絲，自然曬干稱重后豆?jié){機(jī)打碎備用。

土壤進(jìn)行高壓滅菌，121℃滅菌30 min，取出后晾2 h，進(jìn)行第2次滅菌，方法同上，之后自然晾干備用。

1.3樣品采集與處理

分別在苗期取樣5次(播種后23，26，29，32，35 d)，現(xiàn)蕾期取樣1次(50 d)，盛花期1次(65 d)，每處理隨機(jī)取樣6株，帶回實(shí)驗(yàn)室后取處理莖基部發(fā)病組織1 g用于測(cè)定胞壁降解酶，設(shè)3次重復(fù)。

于播種30 d后取對(duì)照健康幼苗莖基部，用無菌水沖洗3遍后，剪成3 cm的小段，放在盛有0.8%的500 mL水瓊脂的盤中，將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的病原菌菌餅(0.9 mm)接種于莖段上，每莖段接種一個(gè)菌餅，設(shè)6次重復(fù)。25℃黑暗離體培養(yǎng)，用于觀察立枯絲核菌侵染結(jié)構(gòu)。

于播種后35,50和65 d取對(duì)照莖基部健康組織與處理莖基部發(fā)病組織，無菌水洗滌3遍后切成1 mm3大小的組織塊，3%的戊二醛4℃下固定備用，用于觀察立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯組織和細(xì)胞破壞作用的超微結(jié)構(gòu)變化。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

每次取樣后觀察馬鈴薯形態(tài)特征，記錄病情指數(shù)與發(fā)病進(jìn)程。

1.4立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯侵染過程的觀察

將播種30 d后離體接種培養(yǎng)的馬鈴薯地下莖分別于接種后4，8，12，24，36，48 h取樣，從菌片邊緣橫切制片。以不接菌的健康馬鈴薯苗為對(duì)照。將切片用95%酒精和冰醋酸等量混合固定5 min,然后用0.05%的棉蘭染液染色20 min,在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照[24]。

1.5立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯組織和細(xì)胞的破壞作用

分別取已處理好對(duì)照莖基部健康組織與處理發(fā)病組織，經(jīng)3%的戊二醛4℃下固定后，系列丙酮脫水，Epoin812樹膠包埋，切片染色后用JEM-1230型透射電鏡觀察[25-26]。

1.6立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯莖基部胞壁降解酶活性的影響

1.6.1胞壁降解酶的提取 參照陳夕軍等[21]的方法，在樣品中加入5 mL 0.25 mol/L 氯化鈉提取液，適量石英砂冰浴研磨。過濾后4℃下15000 r/min離心20 min，取上清液(粗酶液)備用。

1.6.2胞壁降解酶的純化 取上述提取的粗酶液，加入硫酸銨至60%飽和度，4℃下靜置5 h后, 1500 r/min離心20 min，棄上清液。用50 mmol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 5.0)溶解沉淀，并在該緩沖液中于4℃ 下透析2 d，每12 h換1次透析液，純化的酶保存在-18℃下備用。

1.6.3胞壁降解酶的測(cè)定 采用紫外—可見光分光光度法測(cè)定胞壁降解酶的活性。取上述粗酶液，分別加入纖維素酶Cx(B-1, 4-內(nèi)切葡聚糖酶)，果膠酶PG(多聚半乳糖醛酸酶)和PMG(果膠甲基半乳糖醛酸酶)的反應(yīng)底物，利用 DNS法在540 nm處測(cè)定OD值，分別計(jì)算活性。酶活單位用每h每g樣品在50℃催化底物生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示(即μg/h·g)[27]。

1.7數(shù)據(jù)處理

用SPSS 21.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，同一時(shí)間不同處理的數(shù)據(jù)采用Duncan法完成；圖表繪制在Microsoft Excel 2007軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯立枯絲核菌的侵染過程

2.1.1馬鈴薯莖潰瘍病發(fā)病進(jìn)程 于播種10 d后開始取樣，觀察到馬鈴薯莖潰瘍病的整個(gè)發(fā)病進(jìn)程：馬鈴薯播種后10 d開始發(fā)育芽，20 d后芽上出現(xiàn)褐色病斑，該部位生長(zhǎng)點(diǎn)壞死，不再繼續(xù)生長(zhǎng)。感病重者幼芽腐爛死亡，形成芽腐，(圖1-1，1-2)。播種30 d后馬鈴薯全部出苗，莖開始發(fā)育，35 d后在莖基部觀察到褐色病斑(莖潰瘍)，感病重者可造成立枯(圖1-3，1-4)。40 d后根系黑褐色菌核或褐色潰瘍，重者腐爛死亡(圖1-5)，此時(shí)匍匐莖開始發(fā)育。50 d后在匍匐莖上可觀察到黑褐色病斑，病斑處不再發(fā)育，頂端不能膨大，不再形成薯塊(圖1-6)。60 d后開始形成薯塊，處理較對(duì)照薯塊體積小，數(shù)量少。75 d后在薯塊上可觀察到少量黑痣，為黑褐色菌核(圖1-7)。90 d后收獲時(shí)，在處理盆栽中發(fā)現(xiàn)，成熟塊莖的感病程度不同，輕者表面形成的黑痣量較少，重者形成大量菌核，其大小形狀不規(guī)則，呈土壤顆粒狀，且不易被沖洗掉，而菌核下邊的組織完好(圖1-8，1-9)。觀察中統(tǒng)計(jì)接種病原菌后植株發(fā)病率為72.5%，有黑痣的塊莖占總塊莖數(shù)的69.2%。結(jié)果表明，立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯的侵染隨著各器官的發(fā)育而發(fā)展，侵染順序依次為：芽-莖-根-匍匐莖-塊莖。

2.1.2馬鈴薯立枯絲核菌侵染結(jié)構(gòu)的形成 取播種30 d后的對(duì)照健康馬鈴薯莖基部離體培養(yǎng)，觀察其顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)接菌4 h后，在培養(yǎng)基表面即可看到菌絲開始沿著莖段表面生長(zhǎng)，但顯微結(jié)構(gòu)顯示尚未看到菌絲(圖2-1)。12 h后，在寄主表面可看到菌絲開始附著生長(zhǎng)(圖2-2)，24 h后附著菌絲少量結(jié)合在一起，開始輕度纏繞，36 h后菌絲頂端開始膨大變粗，分枝增多，分枝再分裂出許多粗短的側(cè)枝，開始形成附著胞的雛形。至48 h后，形成侵染結(jié)構(gòu)，菌絲繼續(xù)分枝，頂端膨大，分枝再不斷分出許多短粗的側(cè)枝，側(cè)枝頂端膨大形成附著胞。菌絲分枝間相互交錯(cuò)，纏繞，逐漸形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2-3)，隨后，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)生出的側(cè)枝緊密結(jié)合在一起，聚集成團(tuán)，形成侵染墊(圖2-4)。侵染墊緊貼在寄主表面，呈橢圓形。

圖1 馬鈴薯莖潰瘍病發(fā)病進(jìn)程

1：播種20 d后對(duì)照馬鈴薯芽；2：播種20 d后處理馬鈴薯芽，出現(xiàn)病斑；3：播種35 d后對(duì)照馬鈴薯莖；4：播種35 d后處理馬鈴薯莖，出現(xiàn)病斑；5：播種40 d后處理馬鈴薯根出現(xiàn)褐色潰瘍斑；6：播種50 d后處理馬鈴薯匍匐莖出現(xiàn)病斑；7：播種75 d后處理馬鈴薯形成少量黑痣；8：播種90 d后形成的少量黑痣；9：播種90 d后形成的大量黑痣。
1:Control potato buds after seeding 20 d; 2:Treatment potato buds show scab after seeding 20 d; 3:Control potato stems after seeding 35 d; 4:Treatment potato stems show scab after seeding 35 d; 5:Treatment potato roots show brown ulceration after seeding 40 d; 6:Treatment potato stolons show scab after seeding 50 d; 7:Treatment potato tubers show little black scurf after seeding 75 d; 8:Treatment potato tubers show little black scurf after seeding 90 d; 9:Treatment potato tubers show more black scurf after seeding 90 d.

圖2 馬鈴薯立枯絲核菌侵染結(jié)構(gòu)的形成

1：接菌4 h后組織結(jié)構(gòu)清晰可見(×100)；2：接菌12 h后可見少量菌絲附著(×100)；3：接菌48 h后形成附著胞，菌絲形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(×100)；4：網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成侵染墊(×100)。
1:Organizational structure is clearly visible after inoculation 4 h(×100); 2:Few hyphae were attached after inoculation 12 h (×100); 3:Appressoria formation and hyphae a mesh structure 48 h after inoculation(×100); 4:Infection cushions formed (×100).

2.2立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯組織和細(xì)胞的破壞作用

透射電鏡的結(jié)果顯示在菌絲侵入前，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞壁，質(zhì)膜完整光滑，核質(zhì)豐富。質(zhì)體(主要為造粉體)與線粒體等細(xì)胞器緊靠細(xì)胞壁排列，形態(tài)規(guī)則正常。菌絲侵入后馬鈴薯莖基部細(xì)胞發(fā)生了明顯的變化。播種后35 d電鏡結(jié)果顯示細(xì)胞壁縫隙增大，細(xì)胞壁變形，粗細(xì)不均(圖3-1，3-2)，菌絲可穿透淀粉粒，淀粉粒體積變大，數(shù)量增多(圖3-3，3-4)，并擠壓細(xì)胞核，使核縊縮(圖3-5)；播種后50 d結(jié)果顯示對(duì)細(xì)胞器造成了影響，質(zhì)體結(jié)構(gòu)變形，片層結(jié)構(gòu)消失(圖3-6，3-7)，同時(shí)細(xì)胞壁斷裂，細(xì)胞膜破損(圖3-8)；播種后65 d結(jié)果顯示，細(xì)胞質(zhì)溶解，質(zhì)壁分離，細(xì)胞器離壁，結(jié)構(gòu)松散(圖3-9)。

圖3 立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯組織和細(xì)胞的破壞作用

1：對(duì)照馬鈴薯細(xì)胞壁膜完整(×20000)；2：處理馬鈴薯細(xì)胞壁變形(×20000)；3：對(duì)照馬鈴薯淀粉粒(×5000)；4：處理馬鈴薯淀粉粒，數(shù)量增多，體積變大(×5000)；5：菌絲穿透淀粉粒，并擠壓細(xì)胞核(×10000)；6：對(duì)照馬鈴薯質(zhì)體片層結(jié)構(gòu)清晰(×10000)；7：處理馬鈴薯質(zhì)體變形，片層結(jié)構(gòu)消失(×15000)；8：對(duì)照馬鈴薯細(xì)胞膜破損(×10000)；9：處理馬鈴薯細(xì)胞質(zhì)溶解，質(zhì)壁分離(×5000)。
1:The normal structure of cell membrane in control potato (×20000); 2:Deformation of potato cell wall in treatment potato (×20000); 3:Starch grains in control potato (×5000); 4:More and bigger starch grains in treatment potato (×5000); 5:Hyphae penetrate starch grains and squash nuclear (×10000); 6:Plastid lamellar structure is distinct in control potato (×10000); 7:Plastid structural deformation, lamellar structure disappearance in treatment potato (×15000); 8:Cell membranes damage in treatment potato (×10000); 9:Cytoplasm dissolution and plasmolysis (×5000).

2.3立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯莖基部胞壁降解酶活性的影響

圖4 不同時(shí)期纖維素酶(Cx)活性變化

試驗(yàn)結(jié)果表明，處理馬鈴薯莖基部組織的兩種果膠酶，多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和纖維素酶(Cx)的活性均高于對(duì)照。

2.3.1立枯絲核菌對(duì)纖維素酶活性的影響 如圖4所示，處理馬鈴薯在播種后23 d酶活性達(dá)到最高峰，達(dá)到1.7 μg/(h·g)，顯著高于對(duì)照，至播種后50 d，酶活性略有下降，但始終與對(duì)照差異顯著。

2.3.2立枯絲核菌對(duì)果膠酶活性的影響 PG活性測(cè)定結(jié)果如圖5所示，測(cè)定時(shí)期內(nèi)處理活性始終顯著高于對(duì)照。播種23 d后酶活性最高，達(dá)到2.9 μg/(h·g)，高于對(duì)照141.67%。略下降后又呈上升趨勢(shì)，在32 d時(shí)上升到第2個(gè)活性高峰，達(dá)到2.6 μg/(h·g)，之后呈下降趨勢(shì)。

圖5 不同時(shí)期多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性變化

圖6 不同時(shí)期果膠甲基半乳糖醛酸酶(PMG)活性變化

如圖6所示，病原菌對(duì)馬鈴薯莖基部PMG活性造成了顯著影響，在播種后23 d處理馬鈴薯莖基部酶活性顯著高于對(duì)照，達(dá)到3.1 μg/(h·g)，為對(duì)照的2倍。在26 d時(shí)開始呈下降趨勢(shì)，50 d后處理與對(duì)照酶活性基本相同，無顯著差異。

根據(jù)已有的研究表明，立枯絲核菌侵染馬鈴薯主要是在出苗之前，對(duì)芽的侵染帶來出苗率低等問題[15]，因此本實(shí)驗(yàn)在苗期連續(xù)取樣，結(jié)果顯示，在播種23 d后，處理馬鈴薯莖基部胞壁降解酶活性含量均為最高，分別達(dá)到1.7，2.9和3.1 μg/(h·g)，其中PG與 PMG活性為對(duì)照的兩倍。說明它們?cè)诓“咝纬苫驍U(kuò)展過程中可能交替或協(xié)同發(fā)揮作用。

3 討論

本研究通過盆栽試驗(yàn)，首次觀察到立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯芽、莖、根等器官的侵染過程，研究表明，病原菌對(duì)馬鈴薯各器官的侵染都隨著器官發(fā)育而發(fā)展，侵染順序依次為：芽-莖-根-匍匐莖-塊莖。病原菌侵染寄主植物后依次形成：芽上的褐色病斑、芽腐，莖基部形成褐色病斑，植株立枯，根系黑褐色菌核或褐色潰瘍，根系腐爛死亡，匍匐莖黑褐色病斑，頂端不再膨大，薯塊上形成黑痣。并發(fā)現(xiàn)一般在器官形成10 d左右可觀察到病斑出現(xiàn)。對(duì)馬鈴薯莖潰瘍病已有的研究表明，隨著生育期的延長(zhǎng)，感病程度增加，器官表面形成菌核后，變?yōu)楹诤稚“?，繼而莖基部潰瘍斑造成立枯，最后出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，使芽、莖、根等都不能繼續(xù)生長(zhǎng)，器官死亡[13,28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在立枯絲核菌的侵染過程中，會(huì)形成附著胞與侵染墊的侵染結(jié)構(gòu)，但與在小麥，水稻及玉米上已有的研究結(jié)果相比有差異。本研究中尚未發(fā)現(xiàn)劉雪梅和肖建國(guó)[29]研究發(fā)現(xiàn)的菌絲圈結(jié)構(gòu)，與陶家鳳[30]的研究結(jié)果類似。在形成侵染結(jié)構(gòu)的時(shí)間上不同作物也存在差異，本研究表明，在接種24 h后出現(xiàn)侵染結(jié)構(gòu)雛形，36 h后形成附著胞，48 h后形成侵染墊，繼而再通過表皮或直接進(jìn)入組織?？赡茉诮臃N36～48 h侵入寄主。陳捷等[31]在玉米上的研究結(jié)果顯示，侵染時(shí)間在12～24 h之間，也晚于陶家鳳[30]對(duì)水稻的研究，該研究表明在接種10～12 h后侵入寄主，16 h即可在寄主細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)立枯絲核菌菌絲。

立枯絲核菌在不同作物上形成侵染結(jié)構(gòu)的種類和入侵時(shí)間之間存在差異，可能原因一是立枯絲核菌對(duì)不同寄主侵染過程不同，二是立枯絲核菌種類較多，根據(jù)陶家鳳[30]的研究表示不同融合群之間入侵時(shí)間不同，因此菌株的差異也可能帶來入侵時(shí)間與侵染結(jié)構(gòu)的不同。具體原因有待進(jìn)一步研究。

病原菌接種后馬鈴薯莖基部出現(xiàn)黑褐色潰瘍病斑，電鏡結(jié)果顯示，立枯絲核菌侵染馬鈴薯莖基部后，可使莖基部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細(xì)胞遭受破壞。

胞壁降解酶測(cè)定結(jié)果表示，在對(duì)照健康莖基部組織中均可測(cè)到Cx、PG和PMG，但活性較低，可能是正常的馬鈴薯莖基部細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生少量的胞壁降解酶，當(dāng)接種病原菌后，病原菌產(chǎn)生酶或刺激寄主本身酶活性提高[32]，導(dǎo)致處理后馬鈴薯莖基部胞壁降解酶活性上升，顯著高于對(duì)照。35 d后開始呈下降趨勢(shì)，至65 d基本與健康組織活性相同，說明此時(shí)酶活性相應(yīng)恢復(fù)到正常水平，不再發(fā)揮作用，這與玉米莖腐病[32]，黃瓜棒孢葉斑病[33]，水稻紋枯病[21]，馬鈴薯干腐病[2]的研究結(jié)果一致。表明病原菌接種后對(duì)馬鈴薯植株莖基部細(xì)胞胞壁降解酶活性的提高，可能是馬鈴薯莖基部器官和細(xì)胞受到破壞的重要原因之一。

這一結(jié)論已在其他作物上得到研究證實(shí)。陳夕軍等[21]的研究結(jié)果表明,水稻紋枯病菌產(chǎn)生的胞壁降解酶能引起水稻葉鞘的細(xì)胞膜損傷，并且病斑部胞壁降解酶活性顯著高于健康組織。張紅等[22]的研究結(jié)果表明，果膠酶和纖維素酶可使水稻葉鞘細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，如細(xì)胞壁部分裂解、葉綠體和線粒體損傷等。陳捷等[34]發(fā)現(xiàn)玉米胚根經(jīng)胞壁降解酶處理后，細(xì)胞壁變薄、粗細(xì)不均，局部變形、斷裂，相鄰細(xì)胞壁消失，分離嚴(yán)重，細(xì)胞器分辨不清，結(jié)構(gòu)松散。這些結(jié)果提示病原菌侵染后，胞壁降解酶具有顯著的致病作用。Pierson和Walker[35]的研究推測(cè)纖維素酶在分解細(xì)胞壁中可能起到重要作用。李寶聚等[36]的研究結(jié)果表明在胞壁降解酶對(duì)黃瓜葉片細(xì)胞的作用過程中，首先是果膠酶降解果膠層，然后是纖維素酶、果膠酶對(duì)柵欄組織的分解，最后是纖維素酶作用于薄壁細(xì)胞壁，二者協(xié)同作用于細(xì)胞內(nèi)部組織。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為立枯絲核菌侵染馬鈴薯的過程首先是菌絲在土壤中生長(zhǎng)，擴(kuò)展遇到寄主后開始附著在其表面。附著生長(zhǎng)48 h后，菌絲形成侵染結(jié)構(gòu)，胞壁降解酶活性上升，導(dǎo)致細(xì)胞壁受損，使細(xì)胞壁變形、斷裂，從而使菌絲直接進(jìn)入細(xì)胞，侵入后，纏繞并穿透淀粉粒，推測(cè)可能利用其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷繁殖，之后破壞其他細(xì)胞器，直至細(xì)胞質(zhì)溶解，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞凋亡。從器官發(fā)育、菌絲附著、侵入細(xì)胞到植株感病，這一過程可能會(huì)歷時(shí)10 d左右完成，因此芽、莖、根等器官發(fā)育10 d后表現(xiàn)出病癥。關(guān)于立枯絲核菌的致病機(jī)理，國(guó)內(nèi)外都有研究，可尚無定論，認(rèn)為立枯絲核菌的致病機(jī)理是復(fù)雜的，在病菌侵染的過程中，胞壁降解酶是如何作用的，還需進(jìn)一步研究。

[1] Xie C H.Potato industry:status and development.Journal of Huazhong Agricultural University(Social Sciences Edition), 2012, 97(1):1-4.

[2] Yang Z M, Bi Y, Li Y C,etal.Changes of cell wall degrading enzymes in potato tuber tissue slices infected byFusariumsulphureum.Scientia Agricultura Sinica, 2012, 45(1):127-134.

[3] Wang B, Ma Y L, Zhang Z B,etal.Potato viruses in China.Crop Protection, 2011, 30:1117-1123.

[4] Lu J W, Qiu H Z, Zhang W M,etal.Characteristics of dry matter and potassium accumulation and distribution in potato plant in semi-arid rainfed areas.Chinese Journal of Applied Ecology, 2013, 24(2):423-430.

[5] Meng P P, Liu X, Qiu H Z,etal.Fungal population structure and its biological effect in rhizosphere soil of continuously cropped potato.Chinese Journal of Applied Ecology, 2012, 23(11):3079-3086.

[6] Li F, Yue Y.Development strategy of potato industrial cluster in Gansu Province.Crops, 2011, (4):11-15.

[7] Wang Y, Yang Z H, Qin Y X,etal.Analysis on anastomosis groups ofRhizoctoniasolaniAG2.1 and AG3 from potato (Solanumtuberosum).Journal of Agricultural Biotechnology, 2013, 21(2):230-237.

[8] Chen S Q, Wang S R.Antagonistic effect of actinomycetes D01 against four strains potato pathogens.Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(5):365-369.

[9] Yu B, Shen B Y, Wang W,etal.Effects of different potato varieties on preventing continuous cropping obstacle in the arid regions.Journal of Gansu Agricultural University, 2012, 47(4):43-47.

[10] Niu X Q, Li J H, Zhang J L,etal.Changes ofFusariumin rhizosphere soil under potato continuous cropping systems in arid-irrigated area of Gansu Province.Acta Prataculturae Sinica, 2011, 20(4):236-243.

[11] Wang F S, Duan X Q, Du Y C.The causes and comprehensive control measures of potato disease in Tongwei county.Gansu Agricultural Science and Technology, 2007, 3:54-55.

[12] Hadi M R, Balali G R.The effect of salicylic acid on the reduction ofRizoctoniasolanidamage in the tubers of marfona potato cultivar.American Eurasian Journal of Agriculture & Environment Science, 2010, 7(4):492-496.

[13] Chen W L.Research progress of black scurf in potatoes.Chinese Potato Journal, 2012, 26(1):49-51.

[14] Zhang X Y, Yu X X, Gao X,etal.The changes on MDA content, cell membrane permeability and PAL activity after inoculating with toxin ofRizoctoniasolaniin potato.Journal of Inner Mongolia Agricultural University, 2012, 33(2):16-20.

[15] Cao C M, Li W G, Zhang J P,etal.The current research status of potato black scurf.Chinese Potato Journal, 2009, 23(3):171-173.

[16] Atkinson D, Thornton M K, Miller J S.Development ofRhizoctoniasolanion stems, stolons and tubers of potatoesⅠ.effect of inoculum source.American Journal of Potato Research, 2010, 87:374-381.

[17] Woodhall J W, Lees A K, Edwards S G,etal.Infection of potato byRhizoctoniasolani:effect of anastomosis group.Plant Pathology, 2008, 57:897-905.

[18] Liu B Y, Hu J, Meng M L,etal.Molecular identification and biological characters of the pathogen causing black scurf disease in potato.Acta Phytophylacica Sinica, 2011, 38(4):379-380.

[19] Qiu G W.The occurrence and prevention of potato black scurf disease.Grain Crop, 2009, (6):133-134.

[20] Zhang R, Li J H, Chai Z X,etal.Screening of biocontrolTrichodermafrom potato rhizosphere of Western Gansu againstFusariumsambucinumand their identification .Acta Prataculturae Sinica, 2009, 18(2):138-145.

[21] Chen X J, Zhang H, Xu J Y,etal.Cell wall degrading enzymes produced byRhizoctoniasolaniand their pathogenicity to rice plants.Jiangsu Journal of Agricultural Science, 2006, 22(1):24-28.

[22] Zhang H, Chen X J, Tong Y H,etal.Damage of cell wall degrading enzymes produced byRhizoctoniasolanito rice tissue and cells.Journal of Yangzhou University (Agricultural and Life Science), 2005, 26(4):84-86.

[23] Chen B, Wang K Y, Dong G Q,etal.The correlations in the pathogenicity to the enzymes activities ofThanatephoruscucumeriscausing rice sheath blight disease.Acta Agriculturae Zhejiang Gensis, 1992, 23(1):19-22.

[24] Zhang X Y.Study on Identification Technology and Resistance Mechanism of Stem Canker and Black Scurf in Potato byRhizotoniasolani[D].Hohhot:Inner Mongolia Agricultural University, 2012.

[25] Chen J H, Li R H, Guo P G,etal.Impact of drought stress on the ultrastructure of leaf cells in three barley genotypes differing in level of drought tolerance.Chinese Bulletin of Botany, 2011, 46(1):28-36.

[26] Zhou E X, Cao J X, Yang M.Research advances in the histopathology of rice sheath blight.Journal of Zhongkai Agrotechnical College, 2002, 15(2):61-65.

[27] Wu J Y.The Species of Cutinase and Cell-wall Degrading Enzymes Produced byBotrytiscinereaand their Pathogenicity to Tomato Plants[D].Yangzhou:Yangzhou University, 2007.

[28] Li Q K, Sun S D, Li M Q.Studies onRhizoctoniadisease in potato.Chinese Potato Journal, 1988, 2(2):79-85.

[29] Liu X M, Xiao J G.Histopathological studies on infection process of wheat sheath blightRhizoctoniacerealis.Mycosystema, 1999, 18(3):288-293.

[30] Tao J F.Studies on the infection process ofRhizoctoniasolaniin rice.Sichuan Agricultural University, 1992, 10(3):471-477.

[31] Chen J, Tang C R, Gao Z G,etal.On penetration process of sheath blight pathogen in maize.Journal of Shenyang Agricultural University, 2000, 31(5):503-506.

[32] Gao Z G, Chen J, Gao H M,etal.The kinds and activity of cell wall degrading enzymes produced from corn stalk rot pathogens.Acta Phytopathologica Sinica, 2000, 30(2):148-152.

[33] Liu Z H, Qi Y, Huang X Y,etal.Conditions and activity analysis of cell wall degrading enzymes produced fromCorynesporacassiicolaof brown spot of cucumber.China Vegetables, 2011, (8):76-80.

[34] Chen J, Gao H M, Ji M S,etal.On the pathogenicity of CWDEs produced from stalk rot pathogens in maize.Acta Phytopathologica Sinica, 1998, 28(3):221-226.

[35] Pierson C F, Walker J C.Relation ofCladosporumcucumerinurto susceptible and resistant cucumber tissue.Phytopathology, 1954, (44):459-465.

[36] Li B J, Zhou C L, Zhao K H,etal.Pathogenic mechanism of scab of cucumber caused byCladosporiumcucumerinumⅢ effects and synergism of cell wall-degrading enzymes and toxin produced byC.cucumerinumon ultrastructure of cucumber.Acta Phytopathologica Sinica, 2001, 31(1):63-69.

參考文獻(xiàn)：

[1] 謝從華.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與發(fā)展.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(社會(huì)科學(xué)版), 2012, 97(1):1-4.

[2] 楊志敏, 畢陽(yáng), 李永才, 等.馬鈴薯干腐病菌侵染過程中切片組織細(xì)胞壁降解酶的變化.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 45(1):127-134.

[4] 盧建武, 邱慧珍, 張文明, 等.半干旱雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)區(qū)馬鈴薯干物質(zhì)和鉀素積累與分配特性.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2013, 24(2):423-430.

[5] 孟品品, 劉星, 邱慧珍, 等.連作馬鈴薯根際土壤真菌種群結(jié)構(gòu)及其生物效應(yīng).應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2012, 23(11):3079-3086.

[6] 李福, 岳云.甘肅省馬鈴薯產(chǎn)業(yè)集群發(fā)展思路.作物雜志, 2011, (4):11-15.

[7] 王宇, 楊志輝, 秦宇軒, 等.馬鈴薯黑痣病菌AG2.1和AG3融合群分析.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2013, 21(2):230-237.

[8] 陳淑琴, 王生榮.放線菌D01對(duì)馬鈴薯4種病原真菌的抑菌作用.草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(5):365-369.

[9] 余斌, 沈?qū)氃? 王文, 等.連作障礙對(duì)干旱地區(qū)不同馬鈴薯品種的影響.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(4):43-47.

[10] 牛秀群, 李金花, 張俊蓮, 等.甘肅省干旱灌區(qū)連作馬鈴薯根際土壤中鐮刀菌的變化.草業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 20(4):236-243.

[11] 王鳳山, 段禳全, 杜銀川.通渭縣馬鈴薯病害發(fā)生原因及綜合防治措施.甘肅農(nóng)業(yè)科技, 2007, (3):54-55.

[13] 陳萬利.馬鈴薯黑痣病的研究進(jìn)展.中國(guó)馬鈴薯, 2012, 26(1):49-51.

[14] 張笑宇, 于肖夏, 高翔, 等.馬鈴薯黑痣病菌毒素誘導(dǎo)馬鈴薯幼苗丙二醛含量、細(xì)胞膜透性及 PAL 活性的變化.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 33(2):16-20.

[15] 曹春梅, 李文剛, 張建平, 等.馬鈴薯黑痣病的研究現(xiàn)狀.中國(guó)馬鈴薯, 2009, 23(3):171-173.

[18] 劉寶玉, 胡俊, 蒙美蓮, 等.馬鈴薯黑痣病病原菌分子鑒定及其生物學(xué)特性.植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2011, 38(4):379-380.

[19] 邱廣偉.馬鈴薯黑痣病的發(fā)生與防治.糧食作物, 2009, (6):133-134.

[20] 張茹, 李金花, 柴兆祥, 等.甘肅河西馬鈴薯根際生防木霉菌對(duì)接骨木鐮刀菌的拮抗篩選及鑒定.草業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 18(2):138-145.

[21] 陳夕軍, 張紅, 徐敬友, 等.水稻紋枯病菌胞壁降解酶的產(chǎn)生及致病作用.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 22(1):24-28.

[22] 張紅, 陳夕軍, 童蘊(yùn)慧, 等.紋枯病菌胞壁降解酶對(duì)水稻組織和細(xì)胞的破壞作用.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2005, 26(4):84-86.

[23] 陳兵, 王坤元, 董國(guó)強(qiáng), 等.水稻紋枯病菌的致病性與酶活力的關(guān)系.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1992, 23(1):19-22.

[24] 張笑宇.馬鈴薯抗黑痣病鑒定技術(shù)及其抗病機(jī)制研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[25] 陳健輝, 李榮華, 郭培國(guó), 等.干旱脅迫對(duì)不同耐旱性大麥品種葉片超微結(jié)構(gòu)的影響.植物學(xué)報(bào), 2011, 46(1):28-36.

[26] 周而勛, 曹菊香, 楊媚.水稻紋枯病組織病理學(xué)的研究進(jìn)展.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào), 2002, 15(2):61-65.

[27] 吳潔云.灰葡萄孢角質(zhì)酶、胞壁降解酶種類及其對(duì)番茄植株的致病作用[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué), 2007.

[28] 李乾坤, 孫順娣, 李敏權(quán).馬鈴薯立枯絲核菌病的研究.馬鈴薯雜志, 1988, 2(2):79-85.

[29] 劉雪梅, 肖建國(guó).小麥紋枯病菌侵染過程的組織學(xué)研究.菌物系統(tǒng), 1999, 18(3):288-293.

[30] 陶家鳳.立枯絲核菌對(duì)水稻侵染過程的研究.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1992, 10(3):471-477.

[31] 陳捷, 唐朝榮, 高增貴, 等.玉米紋枯病病菌侵染過程研究.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 31(5):503-506.

[32] 高增貴, 陳捷, 高洪敏, 等.玉米莖腐病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶種類及其活性分析.植物病理學(xué)報(bào), 2000, 30(2):148-152.

[33] 劉志恒, 亓燁, 黃欣陽(yáng), 等.黃瓜棒孢葉斑病(褐斑病)病菌細(xì)胞壁降解酶的產(chǎn)生條件及活性分析.中國(guó)蔬菜, 2011, (8):76-80.

[34] 陳捷, 高洪敏, 紀(jì)明山, 等.玉米莖腐病菌產(chǎn)生的細(xì)胞壁降解酶的致病作用.植物病理學(xué)報(bào), 1998, 28(3):221-226.

[36] 李寶聚, 周長(zhǎng)力, 趙奎華, 等.黃瓜黑星病菌致病機(jī)理的研究Ⅲ細(xì)胞壁降解酶和毒素對(duì)寄主超微結(jié)構(gòu)的影響及其協(xié)同作用.植物病理學(xué)報(bào), 2001, 31(1):63-69.

Pathogenic mechanism ofRhizoctoniasolanipotato blight Ⅰ Micro-structure observation of the infection process and measurement of cell wall degradation enzyme activity

TUO Ning1，2, ZHANG Jun1，2, QIU Hui-Zhen1，2*, ZHANG Wen-Ming1，2, ZHANG Chun-Hong1，2,LIU Xing1，2，ZHU Jing1，2

1.CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China; 2.GansuProvincialKeyLabofAridlandCropScience,Lanzhou730070,China

Stem canker (black scurf disease) caused byRhizoctoniasolanihas become one of the main soil-borne diseases which limit the development of the potato industry in Gansu province.In this study,R.solanispores were inoculated onto the stem base of potato plants grown in pots.The infection process and activity of potato cell wall degradation enzymes was observed and measured.Results showed that the infection sequence was bud, stem, root, stolon and lastly tuber.Hyphae attached to the surface of the host within 12 h, appressoria formed in 36 h, infection cushions formed in 48 h.Deformation and fracture of the cell wall, damage to the cell membrane, and the effects of plasmolysis such as deformation and fracture of the cell wall, damage to the cell and plastid membranes and the dissolution of cytoplasm were then observed under the electron microscope.The activities of cellulase (Cx), polygalacturonase (PG) and polymethyl-galacturonase (PMG) were 1.7, 2.9 and 3.1 μg/(h·g), respectively, and these values were significantly higher than those of the control group.The activities of PG and PMG were as twice those of the control group.The increased enzyme activity may be related to tissue necrosis.

Rhizoctoniasolani; infection process; ultrastructure; transmission electron microscope; cell-wall-degrading enzymes

10.11686/cyxb2015051

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-27；改回日期：2015-03-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360500)，國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103004)和國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD06B03)資助。

拓寧(1989-)，女，甘肅蘭州人，在讀碩士。 E-mail:tuoning1989@126.com

*通信作者Corresponding author.E-mail:hzqiu@gsau.edu.cn

拓寧, 張君, 邱慧珍, 張文明, 張春紅, 劉星, 朱靜.立枯絲核菌對(duì)馬鈴薯侵染過程的顯微結(jié)構(gòu)觀察與胞壁降解酶活性的測(cè)定.草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(12):74-82.

TUO Ning, ZHANG Jun, QIU Hui-Zhen, ZHANG Wen-Ming, ZHANG Chun-Hong, LIU Xing, ZHU Jing.Pathogenic mechanism ofRhizoctoniasolanipotato blightⅠ Micro-structure observation of the infection process and measurement of cell wall degradation enzyme activity.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):74-82.