慢病毒載體靶向介導(dǎo)p66shc基因沉默*

張 嬋，董文斌，趙 帥，李清平，康 蘭，雷小平，郭 琳，翟雪松

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州 646000)

·技術(shù)與方法·

慢病毒載體靶向介導(dǎo)p66shc基因沉默*

張 嬋，董文斌△，趙 帥，李清平，康 蘭，雷小平，郭 琳，翟雪松

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院新生兒科，四川瀘州 646000)

目的 構(gòu)建p66shc基因重組慢病毒表達(dá)載體，并將之轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，通過(guò)RNA干擾致使p66shc基因沉默，為進(jìn)一步研究p66shc基因功能奠定基礎(chǔ)。方法 篩選3個(gè)RNA靶點(diǎn)，命名為p66shc-shc1、p66shc-shc2、p66shc-shc3，與雙酶切后的pLenR-綠色熒光蛋白(GPH)(含有GFP表達(dá))連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的DH5α細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序正確后，與pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP的表達(dá)，證實(shí)病毒包裝成功。使用熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)p66shc在基因及蛋白水平的表達(dá)，選取有效沉默p66shc基因的p66shc-shc1靶點(diǎn)，為后續(xù)試驗(yàn)做準(zhǔn)備。結(jié)果 成功構(gòu)建表達(dá)p66shc的shRNA慢病毒載體并轉(zhuǎn)染至真核生物細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)熒光定量PCR及Western blot技術(shù)檢測(cè)其通過(guò)RNA干擾導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)p66shc基因沉默。結(jié)論 靶向表達(dá)p66shc的shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染入真核生物細(xì)胞內(nèi)可通過(guò)RNA干擾在分子及蛋白水平導(dǎo)致p66shc基因沉默。

慢病毒屬；RNA干擾；p66shc

氧療在新生兒尤其是早產(chǎn)兒急救醫(yī)學(xué)中是必不可少的，長(zhǎng)時(shí)間高濃度和(或)高壓力氧氣吸入常常導(dǎo)致肺部氧化應(yīng)激損傷，但其確切機(jī)制至今仍未完全闡明。作者的前期研究表明，p66shc 參與的氧化應(yīng)激通路在其發(fā)病機(jī)制中占重要位置[1]。p66shc是哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)蛋白，也是近年來(lái)研究細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要蛋白之一，它通過(guò)線粒體內(nèi)氧化細(xì)胞色素C產(chǎn)生大量活性氧(ROS)導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷[2]。本研究擬構(gòu)建靶向介導(dǎo)p66shc基因的重組慢病毒表達(dá)載體，并將之轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，通過(guò)RNA干擾(RNAi)導(dǎo)致p66shc基因沉默，為進(jìn)一步研究p66shc基因功能及其與高氧肺損傷的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，為臨床治療高氧肺損傷提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 pLenR-GPH Vector、DL2 000 ladder Marker、熒光定量PCR試劑、sybr greenⅠ、熒光定量PCR引物、DEPC購(gòu)自Western Biotechnology公司、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ、KpnⅠ購(gòu)自Takara公司；T4 DNA 連接酶、T4 DNA連接酶緩沖液購(gòu)自NEB公司；BSA購(gòu)自Sigma公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成；NucleoBond Xtra Midi Plus引物購(gòu)自Macherey-Nagel公司；AxyPrep 質(zhì)粒小量制備試劑盒購(gòu)自Axygen公司；高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒購(gòu)自Sagon 公司；包裝細(xì)胞293T細(xì)胞株購(gòu)自中科院上海細(xì)胞所；大腸桿菌菌株DH5α購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白裂解液購(gòu)自北京普利萊公司；一抗p66shc購(gòu)自Abcam公司；預(yù)染蛋白marker購(gòu)自Fermentas公司；HRP二抗、內(nèi)參一抗購(gòu)自GenScript公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自FTC2000公司；測(cè)序儀購(gòu)自Invitrogen 公司；穩(wěn)壓DNA電泳儀購(gòu)自BioRad公司；凝膠成像儀購(gòu)自博迅儀器公司；熒光倒置顯微系統(tǒng)購(gòu)自Leica公司。

1.2 方法

1.2.1 LV-shRNA載體的構(gòu)建及其鑒定 針對(duì)p66shc基因序列(NM-183001.4)，利用 siRNA設(shè)計(jì)程序按照RNAi序列設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)多個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，根據(jù)設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行評(píng)估測(cè)定，選定3個(gè)最佳的動(dòng)力學(xué)參數(shù)靶點(diǎn)，基因序列為：p66shc-shc1：5′-CCG CTT TGA AAG TGT CAG TCA-3′,p66shc-shc2:5′-TCA GCT ACC ACA TGG ACA ATC-3′,p66shc-shc3:5′-CCG CTT TGA AAG TGT CAG TCA-3′。由金瑞斯生物合成含干擾序列的雙鏈DNA oligo，其兩端含有BamHⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)黏端，經(jīng)退火形成雙鏈DNA。將pLenR-綠色熒光蛋白(GPH)載體(該載體中含有EF1-alpha啟動(dòng)子調(diào)控的GFP表達(dá)) 用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切成線性，1%瓊脂糖電泳呈陽(yáng)性，膠回收后，與合成的雙鏈DNA連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的 DH5α細(xì)胞[3]，挑取陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定正確后送華大基因公司測(cè)序鑒定。

1.2.2 慢病毒的包裝 用胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞，細(xì)胞密度為0.5×109個(gè)/L時(shí)，重新接種于25 mL的15 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37 ℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。制備慢病毒包裝系統(tǒng)中4種質(zhì)粒DNA溶液。加入無(wú)菌水定容至1 800 μL,再加入CaCl2(2.5 mol/L) 溶液200 μL，混勻，加入2×BBS溶液2 000 μL，室溫放置20～30 min。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)60%～70%時(shí)轉(zhuǎn)染。將DNA和磷酸鈣混合液轉(zhuǎn)移至含單層細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，培養(yǎng)12 h后棄培養(yǎng)液，PBS沖洗，重復(fù)3次。每瓶細(xì)胞中加入含100 mL/L小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液15 mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后離心收集病毒上清液，將上清液以0.45 μm濾器過(guò)濾，25 000 r/min離心20 min。而后以冰PBS液分別溶于500 μL DMEM和500 μL PBS重旋病毒沉淀于4 ℃溶解過(guò)夜。次日于倒置熒光顯微鏡下檢測(cè)GFP表達(dá)量，并使用逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定慢病毒滴度。

1.2.3 熒光定量PCR檢測(cè)干擾效率 收集293T細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，去上清液，細(xì)胞沉淀中加入1 mL TRIzol，輕輕吹打后室溫靜置，轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中。加入200 μL三氯甲烷，劇烈混勻，室溫靜置2～3 min，離心，吸取上清液，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，室溫靜置10 min，離心棄上清液，每管加入1 mL 75%乙醇潤(rùn)洗，離心棄上清液，加入RNase-free水至完全溶解，抽提的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，設(shè)計(jì)特異性的引物序列(5′-GCA GGA CTC GGG TGG AAG-3′)和綠色熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)p66shc蛋白表達(dá) 培養(yǎng)細(xì)胞去除培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，離心收集，冰上放置數(shù)分鐘,1 200 r/min離心5 min，取上清液，考馬斯亮藍(lán)G250測(cè)定蛋白濃度。取一定量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，取出膜，并做好正反面標(biāo)記，在TBST中清洗1 min，然后用封閉液封閉。用封閉液將對(duì)應(yīng)的一抗稀釋(1∶500)，內(nèi)參一抗稀釋(1∶3 000),然后溫育1.5 h。用TBST清洗3次，每次5 min。用封閉液將二抗稀釋(1∶5 000)，溫育1.5 h。化學(xué)發(fā)光、顯影、定影，用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 LV-shRNA載體的鑒定 挑取重組LV-shRNA載體陽(yáng)性克隆，送至華大基因公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明陽(yáng)性克隆序列正確，可包裝病毒及靶點(diǎn)篩選。同時(shí)將重組質(zhì)粒以限制性內(nèi)切酶KpnⅠ(位于4 290 bp)和EcoR Ⅰ(位于4 620 bp)進(jìn)行酶切鑒定，行瓊脂糖凝膠電泳，空載體酶切片段序列為331 bp，shRNA重組載體酶切序列為331+61(或65 bp)=392(或396 bp)，電泳結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆條帶位于250～500 bp，與預(yù)期相符，LV-shRNA載體構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

2.2 慢病毒的包裝 將所構(gòu)建的p66Shc重組質(zhì)粒與 pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后在熒光倒置顯微鏡下觀察，每孔細(xì)胞均表達(dá)GFP，轉(zhuǎn)染成功，測(cè)定滴度，見(jiàn)圖2～4。

1～3：p66shc-shc1，均為陽(yáng)性克??；4～6：p66shc-shc2，均為陽(yáng)性克??；7：陰性對(duì)照，pLenR-GPH慢病毒空質(zhì)粒；8～10：p66shc-shc2，8、9為陽(yáng)性克??；M：DNA分子標(biāo)記物。

圖1 酶切載體DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

A：明場(chǎng)照片；B：熒光視野。

圖2 p66shc-shc1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光倒置顯微鏡圖片圖(×200)

A：明場(chǎng)照片；B：熒光視野。

圖3 p66shc-shc3 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光倒置顯微鏡圖片圖(×200)

A：明場(chǎng)照片；B：熒光視野。

圖4 p66shc-shc3轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光倒置顯微鏡圖片圖(×200)

2.3 穩(wěn)定沉默p66Shc基因真核細(xì)胞系的建立 連續(xù)培養(yǎng)293T細(xì)胞1個(gè)月，分別提取轉(zhuǎn)染p66Shc-pLenR-GPH慢病毒的293T細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pLenR-GPH空載體慢病毒的293T細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，用p66shc引物和GAPDH引物做熒光定量PCR。結(jié)果顯示，與慢病毒空質(zhì)粒感染的細(xì)胞相比，經(jīng)p66shc慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞p66shc mRNA表達(dá)量降低，p66shc-shc1組下降最為明顯，見(jiàn)圖5，并用2-△△Ct法計(jì)算數(shù)據(jù)。使用 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的p66shc蛋白表達(dá)，用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks4.6軟件分析目的條帶的灰度值，將灰度值數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析做柱狀圖，分析發(fā)現(xiàn)與慢病毒空質(zhì)粒感染的細(xì)胞相比，經(jīng)p66shc慢病毒轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，p66shc蛋白的表達(dá)下降，p66shc-shc1組下降最為明顯，見(jiàn)圖6，表明本研究已經(jīng)成功建立穩(wěn)定沉默p66shc的293T細(xì)胞系，并選取p66shc-shc1組進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A：p66shc溶解曲線；B：內(nèi)參GAPDH溶解曲線；C：p66shc mRNA表達(dá)分析圖，其中a為正常293T細(xì)胞，b為慢病毒空質(zhì)粒感染的293T細(xì)胞，S為p66shc慢病毒感染的293T細(xì)胞，S1、S2、S3分別為p66shc-shc1、p66shc-shc2、p66shc-shc3?！瘢篜<0.05，與正常293T細(xì)胞比較；■：P<0.05,與慢性病毒空質(zhì)粒感染的293T細(xì)胞比較。

圖5 熒光定量PCR檢測(cè)p66shc mRNA的表達(dá)

A：Western blot圖；B：Western blot分析圖，其中a為正常293T細(xì)胞，b為慢病毒空質(zhì)粒感染的293T細(xì)胞，S為p66shc慢病毒感染的293T細(xì)胞，S1、S2、S3分別為p66shc-shc1、p66shc-shc2、p66shc-shc3?！瘢篜<0.05，與正常293T細(xì)胞比較；■：P<0.05,與慢性病毒空質(zhì)粒感染的293T細(xì)胞比較。

圖6 Western blot檢測(cè)p66shc蛋白的表達(dá)

3 討 論

p66shc是一種控制ROS水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，調(diào)控哺乳動(dòng)物生命周期的基因[4]，研究顯示，敲除p66shc基因的老鼠與健康老鼠比較，壽命增加30%，對(duì)氧化應(yīng)激損傷及增齡性病理變化(如動(dòng)脈粥樣硬化)有更強(qiáng)的抵抗力[5-8]。為研究其在細(xì)胞氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡及由此引起的器官損傷中的作用，需在不干擾靶細(xì)胞遺傳特性的前提下沉默p66shc基因。RNAi是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，是一種管理基因表達(dá)的重要工具，對(duì)這一現(xiàn)象的深入研究能為某些人類疾病的治療提供依據(jù)[9-12]。其前提是擁有一種穩(wěn)定、高效、安全的工具將外源基因(RNA或DNA)傳送入靶細(xì)胞內(nèi)。核酸單體不能直接有效的進(jìn)入到細(xì)胞核中，需要如磷酸鈣、脂質(zhì)體、慢病毒等充當(dāng)載體。其中，慢病毒來(lái)源于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，能將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA[13]，其種屬特性為在不需要裂解靶細(xì)胞的前提下將自身基因組整合入靶細(xì)胞的核DNA中[14-15]。因此，慢病毒載體成為最常用的基因轉(zhuǎn)移載體,同時(shí)，慢病毒載體能穩(wěn)定轉(zhuǎn)染分裂期及非分裂期的細(xì)胞，甚至干細(xì)胞，并且較非病毒載體更安全、低毒[16-18]，這些獨(dú)一無(wú)二的特性使得慢病毒載體成為大部分細(xì)胞的高效基因轉(zhuǎn)移載體。本研究成功構(gòu)建了p66Shc慢病毒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致p66Shc基因靶向沉默，為進(jìn)一步研究p66Shc基因的功能及其與高氧誘導(dǎo)新生兒肺損傷的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，相關(guān)研究正在進(jìn)行中。

[1]車忠麗，董文斌，李清平，等．PKCβ/p66Shc氧化應(yīng)激通路介導(dǎo)高氧誘導(dǎo)人肺泡上皮細(xì)胞凋亡的作用[J]．臨床兒科雜志，2013，31(11)：1066-1069．

[2]Gertz M,Steegborn C.The lifespan-regulator p66Shc in mitochondria:redox enzyme or redox sensor[J].Antioxid Redox Signal,2010,13(9):1417-1428.

[3]張麗霞，賈海燕．一種簡(jiǎn)便高效大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41(12)：41-42．

[4]Suski JM,Karkucinska-Wieckowska A,Lebiedzinska M,et al.p66Shc aging protein in control of fibroblasts cell fate[J].Int J Mol Sci,2011,12(8):5373-5389.

[5]Migliaccio E,Giorgio M,Mele S,et al.The p66shc adaptor protein controls oxidative stress response and Life span in mammals[J].Nature,1999,402(6759):309-313.

[6]Menini S,Amadio L,Oddi G,et al.Deletion of p66Shc longevity gene protects against experimental diabetic glomerulopathy by preventing diabetes-induced oxidative stress[J].Diabetes,2006,55(6):1642-1650.

[7]Camici GG,Schiavoni M,Francia P,et al.Genetic deletion of p66(Shc) adaptor protein prevents hyperglycemia-induced endothelial dysfunction and oxidative stress[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007,104(12):5217-5222.

[8]Rota M,Lecapitaine N,Hosoda T,et al.Diabetes promotes cardiac stem cell aging and heart failure,which are prevented by deletion of the p66shc gene[J].Circ Res,2006,99(1):42-52.

[9]Davis ME,Zuckerman JE,Choi CH,et al.Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles[J].Nature,2010,464(7291):1067-1070.

[10]Sashital DG,Doudna JA.Structural insights into RNA interference[J].Curr Opin Struct Biol,2010,20(1):90-97.

[11]RanaTM.Illuminatingthesilence:understandingthestructureandfunctionofsmallRNAs[J].NatRevMol Cell Biol,2007,8(1):23-36.

[12]Heo I,Kim VN.Regulating the regulators:posttranslational modifications of RNA silencing factors[J].Cell,2009,139(1):28-31.

[13]Miller AD,Miller DG,Garcia JV,et al.Use of retroviral vectors for gene transfer and expression[J].Methods Enzymol,1993,217:581-599.

[14]Lewis P,Hensel M,Emerman M.Human immunodeficiency virus infection of cells arrested in the cell cycle[J].EMBO J,1992,11(8):3053-3058.

[15]Lewis PF,Emerman M.Passage through mitosis is required for oncoretroviruses but not for the human immunodeficiency virus[J].J Virol,1994,68(1):510-516.

[16]Escors D,Breckpot K.Lentiviral vectors in gene therapy:their current status and future potential[J].Arch Immunol Ther Exp (Warsz),2010,58(2):107-119.

[17]Mctaggart S,Al-Rubeai M.Retroviral vectors for human gene delivery[J].Biotechnol Adv,2002,20(1):1-31.

[18]Pluta K,Kacprzak MM.Use of HIV as a gene transfer vector[J].Acta Biochim Pol,2009,56(4):531-595.

Study on lentiviral vector target inducingp66shcgene silencing*

ZhangChan,DongWenbin△,ZhaoShuai,LiQingping,KangLan,LeiXiaoping,GuoLin,ZhaiXuesong

(DepartmentofNewbornMedicine,AffiliatedHospital,LuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To constructp66shcgene interfering lentivirus vectors recombination and transfect it to 293T cells,RNA interfering was carried out to inducep66shcgene silence,so as to provide basis for further study of thep66shcfunction.Methods Screening of three RNA targets which were named after p66shc-shc1,p66shc-shc2,p66shc-shc3,cloned into the pLenR - GPH vector,which contained green fluorescent protein(GFP) and transformed into DH5αcells.The positive clone were picked out for right sequencing and transfected to 293T cells with pRsv-REV,pMDlg-pRRE,pMD2G.The expression of GFP in inverted fluorescence microscope confirmed the virus packaging success.Fluorescence quantitative PCR and Western blot technology were used to investigate the expression of p66shc at the molecular and protein levels,p66shc-shc1 target of effective silencingp66shcgene was selected to prepare for subsequent tests.Results The shRNA lentivirus vector was constructed which could express p66shc and was transfected into 293T cells successfully.Fluorescence quantitative PCR and Western blot technology were used to investigatep66shcgene silence by RNA interference.Conclusion The lentivirus RNAi vector of targeted expression p66shc could inducep66shcgene silence at the molecular and protein levels after transfected into 293T cells by RNA interference.

lentiviral vector;RNA interference；p66shc

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.01.026

中華兒科雜志第二屆雙鶴珂立蘇科研基金;四川省教育廳科研基金(08ZA150)；四川省衛(wèi)生廳科研基金(90191)。 作者簡(jiǎn)介：張嬋(1987-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事新生兒疾病的基礎(chǔ)與臨床研究工作?！?/p>

，Tel:13518389718；E-mail：DongWenbin2000@163.com。

K373

A

1671-8348(2015)01-0073-03

2014-08-08

2014-10-19)