三種鼠淋巴引流特點(diǎn)的比較研究*

韓建紅，甘仲霖，李達(dá)兵，朱先玉，藺艷

三種鼠淋巴引流特點(diǎn)的比較研究*

韓建紅，甘仲霖，李達(dá)兵，朱先玉，藺艷

（四川醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州646000）

目的：研究三種鼠不同部位淋巴引流的特點(diǎn)及差異。方法：用墨水作顯色劑，分別注射入KM小鼠、SCID Beige小鼠和SD大鼠后足掌、尾部及前掌皮下，通過(guò)觀察其后肢、腹部及腋窩等處的淋巴結(jié)染色的情況來(lái)探明該區(qū)域淋巴引流的特點(diǎn)及差異。結(jié)果：①SCID Beige小鼠后足的淋巴引流是從腘淋巴結(jié)引流到髂淋巴結(jié)，KM小鼠從髂淋巴結(jié)還流向腎淋巴結(jié)；SD大鼠另有少量流至腹股溝淋巴結(jié)（P＜0.05）。②KM小鼠和SCID Beige小鼠尾部的淋巴引流都沿同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)到腋窩副淋巴結(jié)（P=1.000），SD大鼠則分別經(jīng)雙側(cè)腘淋巴結(jié)和臀淋巴結(jié)流向髂淋巴結(jié)（P＜0.05）。③KM小鼠和SCID Beige小鼠前掌的淋巴都流向腋窩副淋巴結(jié)和腋窩上葉的淋巴結(jié)（P=1.000），SD大鼠是流到腋窩副淋巴結(jié)和腋窩頂部外側(cè)的淋巴結(jié)（P＜0.05）。結(jié)論：三種鼠在后足、尾部和前掌的淋巴引流各不相同。

淋巴引流；SCID Beige；KM小鼠；SD大鼠

在人和哺乳類動(dòng)物中，淋巴系統(tǒng)在腫瘤和外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)中起重要作用，特定部位淋巴結(jié)(lymph node，LN)的增生、腫大常被用做淋巴結(jié)引流區(qū)域炎癥反應(yīng)的特征描述[1]。近年來(lái)免疫缺陷小鼠和免疫抑制模型鼠在腫瘤移植及癌癥轉(zhuǎn)移研究中的應(yīng)用已經(jīng)越來(lái)越廣泛[2]，前哨淋巴結(jié)和腫瘤誘導(dǎo)的新生淋巴管、淋巴引流等也常被用來(lái)診斷各種癌癥的轉(zhuǎn)移[3-5]。移植部位的淋巴引流和前哨淋巴結(jié)的選擇往往是影響研究結(jié)果的重要因素，故而探明試驗(yàn)動(dòng)物不同部位的淋巴引流特點(diǎn)對(duì)免疫學(xué)及腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究具有重要意義。本研究選用國(guó)內(nèi)常用的KM小鼠、免疫缺陷鼠—SCID Beige小鼠以及SD大鼠為研究對(duì)象，以墨水作為顯色劑，著重研究其四肢及尾部淋巴引流的特點(diǎn)及差異。

1 材料與方法

1.1 材料

大小鼠雄雌不限，8～10周齡，各24只。KM小鼠體重為25±5 g，SD大鼠體重為（250±50）g，均由四川醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（生產(chǎn)合格證：SCXK(川)2013-17），SCID小鼠體重（22±3）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（生產(chǎn)合格證：SCXK(京)2012-0001）。中華牌碳素墨水，由重慶市耀輝墨水廠生產(chǎn)；0.2μm過(guò)濾器購(gòu)于Millipore Express公司。

1.2 方法

墨水經(jīng)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾而成。大小鼠用1%戊巴比妥鈉100 mg/kg經(jīng)腹腔注射麻醉。麻醉后將墨水分別注射入后肢足墊、尾根部及前掌的皮下。后足及前掌注射的部位為皮下朝足/爪趾方向，小鼠注射量為20μL/只，大鼠為40μL/只，以皮膚隆起形成皮丘為成功注射的標(biāo)準(zhǔn)，以足/爪掌面變黑為度；尾部注射部位在距肛門1 cm處倆尾靜脈之間，針尖朝頭端方向，小鼠注射量為40μL/只，大鼠注射為200μL/只。并對(duì)隆起的皮丘略加按摩，以促進(jìn)顯色劑的吸收。

1.3 觀察指標(biāo)

30 min后斷頸處死動(dòng)物，解剖并觀察其腘窩、腹股溝、腋窩、臀及腹腔深部等淋巴結(jié)的染色情況，淋巴結(jié)染上黑色為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)鼠種將動(dòng)物隨機(jī)分為三組，觀察不同部位被注射墨汁后，體內(nèi)淋巴結(jié)染色的情況，用SPSS13.0軟件包中分析數(shù)據(jù)，分類資料用頻數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher’s Exact檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 后足掌的淋巴引流及淋巴結(jié)染色情況

后足被注射墨水30 min后，8只KM小鼠均被標(biāo)記出了同側(cè)的腘淋巴結(jié)（Popliteal LN，PO）（圖1A）、髂淋巴結(jié)(Iliac LN，IL)及腎淋巴結(jié)(Renal LN，RE)（圖1B），而腹股溝淋巴結(jié)(Inguinal LN，IN)及腋窩淋巴結(jié)(Axillary LN，AX)均未見著色。8只SCID小鼠的腘淋巴結(jié)和髂淋巴結(jié)的著色同KM小鼠，但未見腎淋巴結(jié)著色（圖1C）。8只SD大鼠被標(biāo)記出同側(cè)腘淋巴結(jié)和髂淋巴結(jié)的同時(shí)腹股溝淋巴結(jié)也被染色，但著色明顯淺于腘淋巴結(jié)和髂淋巴結(jié)（圖1D、1E），腋窩淋巴結(jié)未見著色。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示三種鼠的后足被注射墨汁后淋巴結(jié)染色的結(jié)果互不相同（P＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

圖1 三種鼠后足掌皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色情況

表1 三種鼠后足掌皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色情況比較(n=64)

2.2 尾部的淋巴引流及淋巴結(jié)染色情況尾部注射墨水30 min后，8只KM小鼠和8只SCID小鼠的腹股溝淋巴結(jié)及腋窩副淋巴結(jié)[6-7](Subsidiary Axillary LN，SA)著色（圖2A、2B），而髂淋巴結(jié)未見著色（圖2A、2C）；8只SD大鼠是雙側(cè)腘淋巴結(jié)、雙側(cè)臀淋巴結(jié)(Gluteal LN，GL)及雙側(cè)髂淋巴結(jié)（圖2D、2E）被染色，但腹股溝及腋窩淋巴結(jié)未見著色。KM小鼠和SCID小鼠尾部被注射墨汁后淋巴結(jié)染色結(jié)果無(wú)差異（P=1.000），而SD大鼠與KM小鼠和SCID小鼠的淋巴結(jié)染色結(jié)果均不相同（P＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

圖2 三種鼠尾根部皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色情況

表2 三種鼠尾根部皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色部位比較(n=80)

2.3 前掌的淋巴引流及淋巴結(jié)染色情況

鑒于SD大鼠后足及尾部注射墨水都未能使腋窩處的淋巴結(jié)著色，本研究還比較了三種鼠前爪的淋巴引流情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8只SD大鼠在前爪被注射墨汁后，腋窩副淋巴結(jié)和窩頂部外側(cè)的一個(gè)腋窩淋巴結(jié)都被染色（圖3A），8只KM小鼠和8只SCID小鼠都是腋窩副淋巴結(jié)和腋窩淋巴結(jié)的上葉被染色（圖3B、3C）。KM小鼠和SCID小鼠的前掌被注射墨汁后淋巴結(jié)染色結(jié)果無(wú)差異（P=1.000），而SD大鼠與KM小鼠和SCID小鼠淋巴結(jié)染色的結(jié)果均不相同（P＜0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

圖3 三種鼠前爪皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色情況

表3 三種鼠前爪皮下注射墨水后淋巴結(jié)染色情況比較(n=48)

3 討論

淋巴系統(tǒng)由淋巴管和淋巴器官（淋巴結(jié)和脾等）構(gòu)成。淋巴結(jié)是淋巴管向心行程中不斷經(jīng)過(guò)的淋巴器官，通過(guò)標(biāo)識(shí)淋巴結(jié)可以有效判斷淋巴引流的途徑和特點(diǎn)。小鼠的淋巴結(jié)在正常情況下一般較小，很難與周圍組織和脂肪區(qū)分開，本研究采用由6%碳黑加85%水和一些穩(wěn)定劑制成的普通墨水作為顯色劑，經(jīng)0.2μm濾器過(guò)濾后，使碳顆粒的直徑控制在0.2μm以下，經(jīng)皮下注射可被吸收入淋巴管內(nèi)，并在淋巴結(jié)處大量聚集，使淋巴結(jié)染上顏色，從而有效準(zhǔn)確地標(biāo)識(shí)出淋巴引流的途徑。

本研究中KM小鼠、SCID小鼠和SD大鼠后足皮下的墨汁都使腘淋巴結(jié)、髂淋巴結(jié)染色，表明它們后足的淋巴都可沿后肢經(jīng)腘淋巴結(jié)朝腹部深處引流，沿途經(jīng)過(guò)髂淋巴結(jié)。KM小鼠的淋巴從髂淋巴結(jié)流出后會(huì)到腎淋巴結(jié)，而SCID小鼠在本研究中，無(wú)論是延長(zhǎng)染色時(shí)間還是增大墨汁的注射量，其腎淋巴結(jié)始終未見著色，提示SCID小鼠后肢的淋巴雖然也是朝腹部淋巴結(jié)引流，但并不引流到腎淋巴結(jié)。SD大鼠的淋巴結(jié)染色的結(jié)果則提示其后足的淋巴引流是優(yōu)先從腘淋巴結(jié)到髂淋巴結(jié)，另有少量淋巴直接引流至腹股溝淋巴結(jié)，但很難到達(dá)腋窩淋巴結(jié)。本結(jié)果中KM小鼠和SCID小鼠后足淋巴引流的結(jié)果與呂順增等人[8-9]關(guān)于小鼠后足淋巴引流的報(bào)道結(jié)果相似，但與Maria.I等人報(bào)道的C57BL/6小鼠后肢的淋巴是分別經(jīng)腘淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)引流的結(jié)果明顯不同[10]。說(shuō)明不僅大、小鼠間后肢淋巴引流途徑有差異，不同小鼠間的引流途徑也可能不一樣。本研究中還發(fā)現(xiàn)SCID小鼠和SD大鼠淋巴經(jīng)髂淋巴結(jié)向上并不流入腎淋巴結(jié)，暗示SCID小鼠和SD大鼠的腎淋巴結(jié)并不收集來(lái)自后肢及髂淋巴結(jié)的淋巴回流。

三種鼠尾部注射墨汁后淋巴結(jié)染色的結(jié)果表明KM小鼠和SCID小鼠尾部的淋巴引流均沿同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)引流至腋窩副淋巴結(jié)，而SD大鼠尾部的淋巴是沿尾根部雙側(cè)引流，分別經(jīng)腘淋巴結(jié)和臀淋巴結(jié)再到髂淋巴結(jié)。

SD大鼠后足的墨汁雖能到達(dá)腹股溝淋巴結(jié)但并不能流至腋窩副淋巴結(jié)，而兩種小鼠尾部注射的墨汁卻使得腹股溝淋巴結(jié)和腋窩副淋巴結(jié)明顯染色，暗示SD大鼠的淋巴從腹股溝淋巴結(jié)引流至腋窩副淋巴結(jié)的效率遠(yuǎn)比KM小鼠和SCID小鼠要低。SD大鼠腋窩淋巴結(jié)及其副淋巴結(jié)僅在前爪被注射墨汁時(shí)才出現(xiàn)強(qiáng)染色，表明SD大鼠前肢與后肢及尾部皮下的淋巴引流幾乎沒有重疊，前肢主要流向腋窩淋巴結(jié)及其副淋巴結(jié)，而后肢和尾部主要經(jīng)腹部淋巴結(jié)向上引流。KM小鼠和SCID小鼠的腋窩副淋巴結(jié)不僅接受前肢的淋巴引流，也收納腹股溝淋巴結(jié)向上的引流，所以KM小鼠和SCID小鼠前肢和尾部皮下的淋巴主要沿腹壁淺表淋巴道引流至腋窩副淋巴結(jié)，而后肢皮下的淋巴則沿腹部深淋巴道引流。

本研究中還發(fā)現(xiàn)，大小鼠腋窩淋巴結(jié)的結(jié)構(gòu)并不相同。大鼠腋窩下有3個(gè)淋巴結(jié)，前爪的淋巴僅流向了窩頂部外側(cè)的一個(gè)淋巴結(jié)。KM小鼠和SCID小鼠腋窩淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)相似，分成了上下兩葉，前爪的淋巴流向腋窩淋巴結(jié)的上葉。此結(jié)果表明大小鼠腋窩淋巴結(jié)叢不僅匯集前爪的淋巴回流，還收納著更廣泛區(qū)域的淋巴回流，如軀干和背部等部位[9]。但每個(gè)或每葉腋窩淋巴結(jié)收納的淋巴回流區(qū)域是否有交叉尚待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，三種鼠在后足、尾部和前掌的淋巴引流各不相同。兩種小鼠在尾部和前掌皮下的淋巴引流相似，而大鼠與小鼠間差別較大。探明不同大小鼠淋巴引流的特點(diǎn)將為淋巴系統(tǒng)相關(guān)研究提供正確的解剖位點(diǎn)及理論依據(jù)。

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（2015-04-28收稿）

Comparative study of lymphatic drainage patterns on three species of murine

Han Jianhong，Gan Zhonglin，Li Dabing，Zhu Xianyu，Lin Yan
Institute of Medical Oncology，Sichuan Medical University

Objective：To investigate the patterns of lymphatic drainage in KM mice，SCID Beige mice and SD rats and their differences.Methods:The animals’lymphatic drainages were observed and identified through injecting ink into their hind feet，tails or forepaws subcutaneously.Results：①The lymph in hind foot went from hind leg through popliteal lymph node to iliac lymph node in SCID Beige mice，while in KM mice lymph drained through iliac lymph node to renal lymph node，and in SD rats there was a minor drainage to inguinal lymph node while mostlymph returned to popliteallymph node(P＜0.05).②In KM and SCID Beige mice lymph in tails went through inguinal lymph node to subsidiary-axillary lymph node(P=1.000)，but in SD rats，lymph drained through bilateral popliteal lymph nodes and bilateral gluteal lymph nodes into bilateral iliac lymph nodes(P＜0.05).③In two kinds of mice lymph in forepaws drained to subsidiary-axillary lymph node and up-axillary lymph node(P=1.000)，but drained to subsidiary-axillary lymph node and outside one of the three axillary lymph nodes in SD rats(P＜0.05).Conclusion：The lymphatic drainage from hind foot，tail and forepaw are differentin three species of murine.

Lymphatic drainage;SCID Beige;KM mouse;SD Rat

Q95-33

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.04.018

*四川省科技廳創(chuàng)新苗子工程（2014-084）

韓建紅（1985-），女，實(shí)習(xí)研究員，碩士

藺艷，（1973-），女，副教授，碩士，E-mail:lydemail@lzmc.edu.cn