miR－514在腎癌中的異常表達及其臨床意義

楊媛慧，路瑞靜，楊會林，余振東

（1.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518036；2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東深圳518133；3.北京大學深圳醫(yī)院生物治療室，廣東深圳518036）

miR－514在腎癌中的異常表達及其臨床意義

楊媛慧1，路瑞靜2，楊會林1，余振東3＊

（1.北京大學深圳醫(yī)院檢驗科，廣東深圳518036；2.深圳市寶安區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東深圳518133；3.北京大學深圳醫(yī)院生物治療室，廣東深圳518036）

目的 探討miR－514在腎細胞癌中的表達變化及其臨床意義。方法 提取45例腎癌及其癌旁正常組織中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后用實時熒光定量PCR的方法檢測miR－514在腎癌組織和癌旁正常組織中的表達情況，并分析其與腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 與相應(yīng)癌旁組織相比，miR－514在腎癌組織中表達量顯著下調(diào)，下調(diào)率為86.67%。miR－514表達水平與患者年齡、性別、病理分型、TNM分期沒有關(guān)系，但其表達水平與Fuhrman分級有關(guān)。結(jié)論 miR－514可能與腎癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，進行miR－514表達水平的研究可能對腎癌的早期診斷及治療具有潛在的臨床意義。

微小RNA；miR－514；腎細胞癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0933）

腎癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制尚未完全清楚，探索腎癌的致病因素對于了解腎癌的發(fā)病機制有著重要的意義。MicroRNA（miRNAs）是一類在多細胞生物中廣泛分布的長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA［1，2］。突變或異常表達的miRNAs被認為發(fā)揮致癌或者抑癌作用，從而參與人類多種腫瘤的發(fā)生，包括腎癌、肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等［3－6］。迄今為止，以早期診斷及治療癌癥為宗旨進行miRNAs的功能與癌癥形成的相關(guān)性研究已成為國內(nèi)外的熱點課題之一。Zhou等通過第二代基因測序技術(shù)對10例腎細胞癌組織進行miRNAs的表達譜檢測，發(fā)現(xiàn)miR－514在腎細胞癌組織中表達差異顯著，癌組織較癌旁組織表達明顯下調(diào)［7］。但目前為止，仍沒有相關(guān)實驗研究進一步證實這一檢測結(jié)果。本實驗主要采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測腎細胞癌組織及其相應(yīng)癌旁組織中miR－514的表達水平，從而對測序結(jié)果進行驗證，并分析腎癌中miR－514的表達量與腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系，探討miR－514在腎癌發(fā)展過程中的作用，可能為臨床上腎癌的診斷及治療提供新的生物學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 標本收集 45例腎細胞癌及其相應(yīng)癌旁組織標本主要來自安徽醫(yī)科大學附屬醫(yī)院及中山大學附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)治療的腎癌患者?；颊咝g(shù)前均未作化療、放射治療或免疫治療等抗腫瘤療法。所有患者均簽署知情同意書，并獲得所在醫(yī)院倫理委員會批準。應(yīng)用國際抗癌組織（UTCC）／美國癌癥聯(lián)合會（AJCC）臨床分期標準對腎癌患者進行臨床病理分期。所得標本保存于RNAlater中并置于液氮或－80℃低溫冰箱。45例腎癌患者的臨床病理資料見表1。

表1 45例腎癌患者的臨床病理資料

1.2 主要試劑及儀器 miRNAs逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（miScript Reverse Transcription Kit）及熒光定量PCR試劑盒（miScript SYBR Green PCR Kit）均購自Qiagen公司（德國），特異性miR－514引物由Invitrogen公司（美國）合成，上游引物序列為：5’－ATTGACACTTCTGTGAGTAGA－3’。內(nèi)參基因U6作為內(nèi)參照進行歸一化，其上游引物為5’－ACGCAAATTCGTGAAGCGTT－3’，下游引物均為miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒提供的通用引物。實驗中用到的主要儀器：普通PCR儀（Bio－RAD）、熒光定量PCR儀（Lightcycler480II Roche）、電泳儀（Bio－RAD）、離心機（eppendor）、臺式高速冷凍離心機（BECKMAN COULTER）、普通冰箱及－80℃超低溫冰箱。

1.3 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol法分別提取45例腎癌組織及相應(yīng)癌旁組織的總RNA。主要抽提步驟如下：①取－80℃凍存的腎癌及其相應(yīng)的癌旁組織各50mg，在液氮中研磨；②加入1ml Trizol試劑（Invitrogen，美國），繼續(xù)研磨成粉末狀提取RNA；③用氯仿、100%異丙醇、75%乙醇分離并洗滌RNA沉淀；④用30μl無RNase Hσ2O溶解RNA。RNA提取完成后，用紫外光分光光度儀測定RNA的濃度及質(zhì)量，并進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，－80℃保存?zhèn)溆?。按照miScript Reverse Transcription Kit試劑盒說明書依次加入模板RNA和反應(yīng)試劑，1μg RNA＋4μl Buffer RT＋2μl Nucleics Mix＋2μl Reverse Transcriptase Mix＋適量H2O，總反應(yīng)體系為20μl。在普通PCR儀（Bio－RAD）上進行反應(yīng)，條件為37℃、1h，95℃、5min。

1.4 實時熒光定量PCR檢測 按照miScript SYBR Green PCR Kit說明書提供的方法，在Roche480定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，檢測miR－514的相對表達量。反應(yīng)條件為：第1步，95℃、15min；第2步，94℃、15S，55℃、30 S，70℃、30S，共45循環(huán)。每次反應(yīng)均設(shè)置3個平行復(fù)孔。本實驗設(shè)實驗組和對照組兩組。腎癌組織miRNAs表達量作為實驗組（c）；相應(yīng)癌旁組織miRNAs表達量為對照組（n）。miR－514作為兩組的目的基因，U6作為內(nèi)參進行標準化處理。CT值表示反映熒光強度到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)?！鰿Tc＝CTc目－CTc內(nèi)，△CTn＝CTn目－CTn內(nèi)。目的基因的相對表達量（Re）采用△△CT的方法進行分析，△△CT＝△CTc－△CTn，Re＝ 2－△△CT［8］。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳 取1.4節(jié)中的擴增產(chǎn)物各5μl，與Loading Buffer均勻混合后加樣至2%瓊脂糖凝膠孔隙中。設(shè)電泳電壓120V，時間30min。

1.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。采用配對樣本t檢驗分析腎癌及其相應(yīng)癌旁組織的miR－514的表達差異；miR－514的表達量與腎癌患者臨床病理特征的關(guān)系采用Mann－Whitney秩和檢驗。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與質(zhì)控 RNA提取完成后進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外照膠儀下顯像示28S、18S兩條清晰的主帶，且28SrRNA在亮度上約為18SrRNA的2倍，兩條帶之間無彌散現(xiàn)象；紫外光分光光度儀檢測RNA濃度均大于300ng／μl，260／280比值于1.8－2.0之間，表明提取的RNA濃度及質(zhì)量良好。

2.2 實時熒光定量PCR擴增曲線及溶解曲線分析各樣本經(jīng)定量PCR擴增后，其擴增曲線均呈典型的“S”型，溶解曲線結(jié)果顯示，miR－514及U6的基因產(chǎn)物均為單特異峰，峰值之前曲線平滑，沒有明顯的雜峰，說明沒有引物二聚體及非特異性擴增產(chǎn)物，見圖1。

圖1 miR－514及U6實時熒光定量PCR擴增曲線及溶解曲線

2.3 miR－514在腎癌組織中低表達 miR－514的相對表達量（Re）經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后得出－△△CT值，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，表示癌組織與癌旁組織中miR－514的相對表達差異。運用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，如圖2所示，miR－514在腎癌組織中呈顯著低表達（t＝－7.01，P＜0.001）。45例配對標本中，miR－514下調(diào)表達的有39例，下調(diào)率為86.67%，見圖2。

圖2 miR－514在45例腎癌組織中的相對表達量

2.4 定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果 電泳結(jié)果顯示，癌組織標本的條帶明顯比癌旁組織標本暗，說明miR－514在腎癌組織中顯著下調(diào)，電泳結(jié)果與實時熒光定量PCR檢測結(jié)果一致（圖3）。

2.5 miR－514表達量與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系 采用Mann－Whitney秩和檢驗分析發(fā)現(xiàn)，miR－514的表達水平在高年齡組（＞53）及低年齡組（＜53）、性別、病理類型及TNM分期之間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而在Fuhrman分級中的G1－2和G3－4級之間的差異有統(tǒng)計學意義（T＝171，P＝0.031）。見表2。

圖3 3例腎癌組織及其相應(yīng)癌旁組織的定量PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

表2 miR－514表達量與腎癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

3 討論

泌尿系統(tǒng)中，腎癌是繼前列腺癌和膀胱癌之后的第三大腫瘤［9］，約占成人惡性腫瘤的2%－3%［10］，但其致死率卻高達40%［11］，目前全世界每年死于腎癌的患者有近10萬例［12］，對人類的健康與生存構(gòu)成了嚴重威脅。由于早期癥狀不明顯，所以一直沒有找到有效的方法來檢測早期腎癌的發(fā)生。現(xiàn)有的放射性療法、化學治療及免疫治療，都錯過治療的最佳時期，并且會產(chǎn)生嚴重的副作用。因此，尋找腎癌診斷與治療的新靶點已成為臨床上迫切需要解決的實際問題。

目前，腫瘤中miRNAs的表達和功能是研究的熱點問題。越來越多的研究表明miRNAs在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了至關(guān)重要的作用［13］。如miR－10b抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移［14］；miR－141和miR－200通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)作用于卵巢腫瘤發(fā)生［15］；miR－192調(diào)控靶基因rb1來抑制肺癌細胞的增殖并促進其凋亡［16］。這些研究證實了miRNAs在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌或致癌的角色。

第二代基因測序的發(fā)展為腫瘤miRNAs表達譜的檢測提供了比較成熟的技術(shù)平臺，Zhou等應(yīng)用第二代大規(guī)模平行測序技術(shù)檢測腎癌組織miRNAs的表達譜，發(fā)現(xiàn)與相應(yīng)的癌旁組織相比，miR－514在腎癌組織中表達明顯下調(diào)［7］。本次研究中，我們主要應(yīng)用實時熒光定量PCR技術(shù)著重對miR－514在45例腎癌及其相應(yīng)癌旁組織中的表達進行驗證。將得到的實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理后，發(fā)現(xiàn)在45例標本有39例腎癌標本中miR－514的表達明顯低于其在癌旁正常組織中的表達，僅有6例腎癌標本中miR－514的表達高于其在癌旁組織中的表達，平均降低4.14倍，其結(jié)果具有統(tǒng)計學意義（t＝－7.01，P＜0.001）。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)miR－514的表達在Fuhrman分級中的G1－2和G3－4級之間的差異有統(tǒng)計學意義（T＝171，P＝0.031）。這表明異常低表達的miR－514與腎癌細胞的分化程度密切相關(guān)，分化程度越低miR－514的表達量就越低，腎癌的惡性程度越高。因而，我們推測miR－514極有可能作為一種重要的抑癌基因，發(fā)揮抑癌基因的作用從而抑制腎癌的發(fā)生與發(fā)展，并且可能作為潛在的腎癌特異性標志物，提高腎癌的早期診斷率。

通過對45例臨床腎癌標本及相應(yīng)癌旁對照組進行初步實驗研究，我們首次驗證了在腎細胞癌及其相應(yīng)癌旁組織中miR－514的表達量的差異，推測miR－514可能作為抑癌基因調(diào)控腎癌的發(fā)生和發(fā)展，實驗設(shè)計簡單、高度特異性、成本低廉及通用性好，可用于檢測多種目的miRNAs?，F(xiàn)階段，關(guān)于miR－514的文獻較少，其在腎癌發(fā)生發(fā)展過程中的功能及作用機制仍處于探索階段尚未明確。但是隨著對miRNAs研究的進一步深入，miR－514很可能在腎細胞癌的早期診斷、靶向治療及預(yù)后判斷等多個方面發(fā)揮重要的作用。

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The abnormal expression of miR－514 in human renal cell carcinoma and its clinical significance

YANG Yuan－h(huán)ui1，LU Rui－jing2，YANG Hui－lin1，et al.（1.Department of Clinical Laboratory，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen518036，China；2.Bao′an District of Shenzhen Maternity and Child Health Hospital，Shenzhen 518133，China）

Objective To investigate the expression levels of miR－514in renal cell carcinoma and its clinical significance.Methods Total RNAs were isolated from 45pairs of human renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues.After reverse transcription，the expression of miR－514was analyzed by quantitative real－time PCR.Then the relationship between the expression level of miR－514and the clinicopathological characteristics was analyzed.Results Compared with the corresponding adjacent tissues，the expression of miR－514in renal cell carcinoma was significantly reduced，with an average of 4.14fold down－regulation.There’s no relation between the expression of miR－514and the age，gender，pathological classification and TNM stage of patients with renal cell carcinoma.However，the expression level of miR－514was related with the Fuhrman grade.Conclusion miR－514may be involved in the development and progression of renal cell carcinoma.This study of miR－514expression may present a potential significance in the early diagnosis and treatment of renal cell carcinoma.

microRNAs；miR－514；renal cell carcinoma

R737.11

A

2014－09－11）

1007－4287（2015）06－0933－04

2014年深圳市科技計劃項目（JCYJ20140415162543037）；2014年深圳市衛(wèi)生計生系統(tǒng)科研項目（201401049）

＊通訊作者