葉酸修飾的重組Apoptin對胃癌治療作用的實驗研究

董 萍，王效杰，王 艷，趙洪禮

（1.沈陽軍區(qū)大連療養(yǎng)院桃源療區(qū)檢驗科，遼寧大連116013；2.沈陽醫(yī)學院；3.東藥集團研究院；4.遼寧何氏醫(yī)學院基礎醫(yī)學院）

葉酸修飾的重組Apoptin對胃癌治療作用的實驗研究

董 萍1，王效杰2，王 艷3，趙洪禮4

（1.沈陽軍區(qū)大連療養(yǎng)院桃源療區(qū)檢驗科，遼寧大連116013；2.沈陽醫(yī)學院；3.東藥集團研究院；4.遼寧何氏醫(yī)學院基礎醫(yī)學院）

目的 研究葉酸修飾的重組Apoptin（以下簡稱rApoptin）在體內(nèi)外對胃癌的治療作用。方法 體外采用MTT法測定rApoptin對胃癌細胞生長抑制率；體內(nèi)用胃癌荷瘤裸鼠研究rApoptin對腫瘤體積增長抑制作用及對裸鼠體重的影響。結果 體外實驗證明rApoptin對胃癌細胞有顯著的生長抑制作用，并有明顯的量效關系；對體內(nèi)腫瘤體積亦有顯著的抑制作用（P＜0.01），病理結果顯示，與對照組比較，實驗組的腫瘤組織細胞發(fā)生大面積壞死或凋亡。結論 rApoptin胃癌組織細胞具有很強的殺傷作用。

腫瘤特異性凋亡因子；胃癌

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0871）

腫瘤特異性凋亡因子（Apoptin）是來源于雞貧血病毒的蛋白質（vp3），對人的各種腫瘤細胞和異常轉化細胞都具有特異性凋亡誘導作用。由于Apoptin能夠選擇性誘導腫瘤細胞和轉化細胞的凋亡，而不誘導正常細胞凋亡，被命名為腫瘤特異性凋亡因子［1－3］。與其他誘導細胞凋亡藥物不同的是，Apoptin對抑癌基因－53（p53）突變的腫瘤細胞也有很強的誘導腫瘤細胞凋亡作用，抑制細胞凋亡基因（Bcl－2）過量表達不但不抑制Apoptin誘導腫瘤細胞凋亡，而且能增強其凋亡誘導作用［4，5］，因此有希望成為有效治療癌癥的新型生物制劑。胃癌是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一，目前還沒有有效的治愈方法，我們在建立了重組GST－Apoptin融合蛋白表達、純化及葉酸修飾方法基礎上［6，7］，本文詳細研究了rApoptin對胃癌細胞體內(nèi)外的殺傷作用，為進一步臨床治療胃癌提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和動物 人胃癌細胞BGC823細胞株購于中國醫(yī)科大學腫瘤研究，培養(yǎng)于含10%小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基中，在5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗；BALB／c裸鼠21只，購于中國醫(yī)科大學動物學部雄性，3－4周齡，13－15g，無特定病原體（SPF）環(huán)境下飼養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 試劑 rApoptin為本室制備，為50μg／支凍干品；3－（4，5－二甲基噻唑－2）－2，5－二苯基四氮唑溴鹽（MTT）Sigma產(chǎn)品；其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 rApoptin體外對胃癌細胞生長抑制作用 采用MTT法測定［6］試驗設PBS組、葉酸組、GSTApoptin組和葉酸＋GST－Apoptin組對照。

1.4 rApoptin體內(nèi)對胃癌荷瘤裸鼠治療作用

1.4.1 裸鼠異種移植瘤治療實驗：參照文獻［8］進行，實驗設Ⅰ組，陰性對照組（生理鹽水）；Ⅱ組和Ⅲ組、低、高劑量藥物組（1.5和2.5mg／kg）。采用瘤內(nèi)注射給藥，隔天給藥一次，共計10次。

1.4.2 觀察指標

①一般觀察指標 參照文獻［8］進行根據(jù)腫瘤體積計算腫瘤生長抑制率，計算瘤重抑瘤率：瘤重抑瘤率＝（1－處理組瘤重／對照組瘤重）×100%。

②HE染色腫瘤細胞形態(tài) 常規(guī)HE方法制備腫瘤組織病理切片，觀察各組腫瘤組織切片的細胞形態(tài)。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，確定P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 rApoptin體外BGC823細胞生長抑制作用

由圖1可見，rApoptin對BGC823細胞生長具有明顯的抑制作用，與對照組相比，rApoptin能明顯抑制腫瘤細胞的增殖（P＜0.05），并存在一定的濃度依賴性，IC50為6.192μg／ml。

圖1 Apoptin對胃癌細胞（BGC823）抑制率量效曲線

圖2 rApoptin對裸鼠體重的影響

圖3 rApoptin對腫瘤體積的抑制作用

2.2 rApoptin對裸鼠及裸鼠移植瘤影響

實驗過程中裸鼠常規(guī)飼養(yǎng)，無自然死亡。從圖2可見實驗期間各處理組的裸鼠體重均有增加，且與NS對照組相比無顯著性差異，提示rApoptin無明顯毒副作用。實驗裸鼠均在接種后7天成瘤，接種后10天腫瘤均長至100mm3左右。從圖3可見rApoptin各處理組的瘤重與NS對照組相比差異均有顯著性（P＜0.01），低、高濃度rApoptin組抑瘤率分別為55.9%、和60.4%。表明rApoptin對人的胃癌細胞的生長具有顯著的抑制作用（表1）。

表1 rApoptin對體內(nèi)胃癌（BGC823細胞）腫瘤體積和腫瘤重量的影響

2.3 rApoptin對胃癌組織的（BGC823細胞）病理結果

見圖5。

3 討論

胃癌是我國常見惡性腫瘤之一，不但治愈率低，而且發(fā)病率在逐年增加，嚴重危害著人們的生命健康，所以研究新的抗胃癌制劑具有很大的社會意義。癌癥傳統(tǒng)治療手段，手術、放療、化療不但不能根除癌癥細胞，而且給機體帶來嚴重損傷和毒性反應，所以人們在不停地尋找安全、有效和低毒或無毒的治療方法。Apoptin發(fā)現(xiàn)和研究結果給人們帶來無傷害性治療惡性腫瘤的希望，因為Apoptin對人體各種組織器官來源的腫瘤細胞具有特異性的凋亡誘導作用，而對正常組織細胞沒有毒副作用，是迄今發(fā)現(xiàn)的沒有毒副作用的抗腫瘤蛋白。由于Apoptin是通過誘導腫瘤細胞凋亡方式殺傷癌細胞的，甚至對剛剛發(fā)生變性的癌前細胞亦有凋亡誘導作用，而腫瘤細胞特點是凋亡異常，無限增生，所以Apoptin非常適合作為抗腫瘤的候選藥物。因為抗腫瘤藥物主要通過誘導細胞凋亡發(fā)揮作用，能否誘導細胞凋亡及誘導凋亡的程度成為評價抗腫瘤藥物的重要指標。

由于Apoptin是來源于雞貧血病毒的蛋白，不能直接與來源于人體的細胞結合，包括正常細胞和腫瘤細胞，種屬間的差異限制了Apoptin在人體來源的癌細胞上的應用，因為從機理上講Apoptin必須進入腫瘤細胞內(nèi)才能發(fā)揮作用?？紤]到腫瘤細胞表面有豐富的葉酸受體，其受體數(shù)量是正常細胞的數(shù)十倍之多，已經(jīng)成為腫瘤治療的一個新的靶向性靶點［12，13］。本課題組采用化學方法將葉酸連接到重組的GST－Apoptin蛋白，解決了GST－Apoptin進入腫瘤細胞的理論問題，獲得令人滿意結果［7］，并獲得國家發(fā)明專利授權。這種葉酸化的Apoptin蛋白比通常采用病毒載體（如腺病毒）將Apoptin基因轉染到腫瘤細胞來發(fā)揮其抗腫瘤作用［9］和用微注射的方法將重組的Apoptin蛋白注射到腫瘤細胞內(nèi)［10，11］要簡單方便，易產(chǎn)業(yè)化。因這兩種技術方法只適合實驗室研究，而不利于臨床應用和產(chǎn)業(yè)化。在此基礎上本文進一步研究葉酸化的rApoptin對我國常見的胃癌細胞體內(nèi)外生長的抑制作用。體外實驗表明rApoptin能夠有效的抑制腫瘤細胞的生長，抑制率可達90%以上；本文研究結果表明：將rApoptin注射于荷人胃癌細胞移植瘤裸鼠后，可明顯抑制移植瘤的生長。其表現(xiàn)為：rApoptin處理組移植瘤生長速度較NS對照組明顯減慢；與NS對照組相比，rApoptin處理組的移植瘤體積、重量均明顯下降，且隨著rApoptin濃度的升高，抑瘤效應加大。對實驗組腫瘤組織的病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞出現(xiàn)大面積的壞死或凋亡，殘留的活細胞很少，并且未見到核分裂細胞，從細胞水平證明rApoptin對胃癌組織細胞具有強烈的殺傷作用。上述實驗結果表明rApoptin是一個很好的抗胃癌蛋白。

圖5 rApoptin對胃癌組織的（BGC823細胞）病理結果（×200）

［1］Yuan L，Zhang L，Dong X，et al.Apoptin selectively induces the apoptosis of tumor cells by suppressing the transcription of HSP70［J］.Tumor Biol，2013，34：577.

［2］Leader B，Baca QJ，Golan DE，et al.Protein therapeutics：a summary and pharmacological classification［J］.Nat Rev Drug Discov，2008，7：21.

［3］Tavassoli M，Guelen L，Luxon BA，et al.Apoptin：specific killer of tumor cells［J］.Apoptosis，2005，10：717.

［4］Zhou S，Zhang M，Zhang J，et al.Mechanisms of Apoptin－induced cell death［J］.Med Oncol，2012，29：2985.

［5］Danen－Van Oorschot AA，Zhang Y，Erkeland SJ，et al.The effect of Bcl－2on Apoptin in‘normal’vs transformed human cells［J］.Leukemia，1999，13（Suppl 1）：S75.

［6］聶 晶，趙洪禮，張偉建，等.雞貧血病毒vp3基因融合表達載體的構建及表達［J］.沈陽部隊醫(yī)藥，2003，16：355.

［7］董 萍，彭海英，高 璐，等.重組Apoptin的葉酸修飾及誘導腫瘤細胞凋亡活性研究［J］.中國療養(yǎng)醫(yī)學，2015，1：30.

［8］周 薇，戴奇剛，利 華，等.EGCG通過下調(diào)Bcl－2、NF－κB（p65）表達，活化Caspase－3誘導人胃癌細胞凋亡的實驗研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2008，4，25.

［9］Li X，Jin N，Mi Z，et al.Antitumor effects of a recombinant fowlpox virus expressing Apoptin in vivo and in vitro［J］.Int J Cancer，2006，119：2948.

［10］Lim S N，Zeenathul N A，Mohd A M，et al.Selective apoptosis induction in MCF－7cell lineby truncated minimal functional region ofApoptin［J］.BMC Cancer，2013，13：488.

［11］Leliveld SR，Dame RT，Mommaas MA，et al.Apoptin protein multimers form distinct higher－order nucleoprotein complexes with DNA［J］.Nucleic Acid Res，2003，31：4805.

［12］Juan－Juan Yin，Sonali Sharma，Stepan P，et al.Synthesis and Biological Evaluation of Novel Folic Acid Receptor－Targeted，b－Cyclodextrin－Based Drug Complexes for Cancer Treatment［J］.PLOS ONE，2013，8，1

［13］Weitman SD，Lark RH，Coney LR，et al.Distribution of the folate receptor GP38in normal and malignant cell lines and tissues［J］.Cancer Res，1992，52：3396.

rApoptin inhibits the growth of human gastric carcinoma BGC823 cells in vitro and its xenograft in nude mice

DONG Ping1，WANG Xiao－jie2，WANG Yang3，et al.（1.First Sanatorium of Dalian，Shenyang Military Command，Dalian 116013，China；2.Academe of Northeast Pharmaceutical Group，Shenyang110027，China）

Objective To investigate the effect of rApoptin on human gastric carcinoma BGC823cells and xenograft growth in nude mice.Methods MTT（methyl thiszolyl tetrazolium）assay was used to determine the inhibition of BGC823cells proliferation by rApoptin.BALB／c nude mice were used to determine antitumor activity in vivo.Results Proliferation of BGC823cells was inhibited in a dose－dependent manner in vitro and the CI50was 6.2μg／ml.rApoptin could suppressed the growth of BGC823xenografts in nude mice by 55%and 60%at 1.5mg／kg and 2.5mg／kg，respectively.HE staining showed most of the tumor cells were died or apoptosis.Conclusion rApoptin could inhibit the growth of human gastric carcinoma BGC823cells in vitro and in vivo effectively.

rApoptin；gastric carcinoma

R735.2

A

2014－07－15）

1007－4287（2015）06－0871－04

遼寧省科技廳科學技術計劃項目（項目編號：2013225086）