慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)組織蛋白酶S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的作用

張智 朱廣志 彭濤 趙國(guó)良 徐靜

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

基礎(chǔ)研究

慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)組織蛋白酶S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的作用

張智 朱廣志 彭濤 趙國(guó)良 徐靜

作者單位：530021 南寧 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科

目的 建立慢病毒介導(dǎo)過(guò)表達(dá)組織蛋白酶S（cathepsin S，Cat S）基因的肝癌細(xì)胞株，觀察Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 利用Age I和EcoR I雙酶切獲得目的基因片段，構(gòu)建靶向過(guò)表達(dá)Cat S基因的慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro，通過(guò)人胚腎上皮293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒制備并感染肝癌MHCC97H細(xì)胞。使用嘌呤霉素加壓篩選，建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cat S基因的肝癌細(xì)胞株。通過(guò)RT-PCR、Western blot、MTT、Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)研究穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和遷移的影響。結(jié)果 成功包裝靶向過(guò)表達(dá)Cat S基因慢病毒載體并感染肝癌MHCC97H細(xì)胞。慢病毒感染后，與空載對(duì)照細(xì)胞Mock-MHCC97H相比，慢病毒CatS-MHCC97H細(xì)胞CatSmRNA、CatS蛋白及MMP-2蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.05），細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力亦明顯增強(qiáng)（P<0.05）。結(jié)論 慢病毒介導(dǎo)的CatS基因過(guò)表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)促進(jìn)肝癌MHCC97H細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，Cat S基因可能是治療肝癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，這為闡明肝癌增殖和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制及提高肝癌基因治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

肝腫瘤；組織蛋白酶S；過(guò)表達(dá)；慢病毒；增殖；遷移

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡(jiǎn)稱“肝癌”）是世界范圍內(nèi)第五位常見(jiàn)癌癥［1］，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年新增病例超過(guò)660 000例［2，3］。診斷技術(shù)的發(fā)展使肝癌能獲得早期診斷和治療［4，5］，但即使早期小肝癌手術(shù)切除后，5年轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率仍然超過(guò)50%［6］。因此，尋找與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感靶蛋白對(duì)研究肝癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要意義。組織蛋白酶S（cathepsin S，Cat S）基因是溶酶體半胱氨酸蛋白酶家族（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）成員之一。研究表明Cat S基因在肺癌、前列腺癌、胃癌和星形細(xì)胞瘤等多種腫瘤中過(guò)表達(dá)［7～10］，而沉默Cat S基因可抑制腺腫瘤模型中腫瘤細(xì)胞的侵襲和血管生成，提示其在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中起重要作用［11］。我們的前期研究結(jié)果表明，Cat S基因在肝癌組織中呈高表達(dá)并和門靜脈癌栓及腫瘤肝外轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［12］。然而，過(guò)表達(dá)Cat S基因在肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲中的作用尚未清楚。為此，本研究通過(guò)慢病毒介導(dǎo)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cat S基因，觀察其對(duì)肝癌MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響，以期闡明Cat S基因在體外對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為肝癌治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株和質(zhì)粒 肝癌MHCC97H細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，該細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒載體pLVXEGFP-3FLAG-Puro，不攜帶紅色熒光的綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記。大腸桿菌DH5α和人胚腎上皮293T細(xì)胞株由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室保存。肝癌MHCC97H細(xì)胞和293T細(xì)胞均培養(yǎng)于10%FBS的DMEM中，細(xì)胞培養(yǎng)條件為恒溫37°C、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.1.2 試劑和儀器 Age I和EcoR I購(gòu)于美國(guó)NEB公司，慢病毒表達(dá)包裝試劑盒（Lenti-PacTMHIV Expression Packaging Kit）購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogene公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物合成購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司，六孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶和Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，Anti-Cat S抗體和 Anti-rabbit HRG酶標(biāo) IgG抗體購(gòu)于美國(guó) Santa Cruz公司，Anti-βactin抗體購(gòu)于美國(guó) Sigma公司，Western blot一抗稀釋液和RIPA裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro構(gòu)建及鑒定 使用EcoR和Xba I對(duì)pLVX-EGFP-3FLAGPuro表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，切去EGFP-3FLAG片段（810 bp），酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收約8.1 kb的載體片段。對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)合成：上游引物為5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3，下游引物為5′-CAGCGGGGCTGCTAAAGCGCATGC-3′。利用EcoR I和Xba I對(duì)化學(xué)合成的目的基因進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后回收約1 kb的目的基因片段。將目的基因連接入表達(dá)載體，將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，恒溫37°C振搖過(guò)夜，從中取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。接種陽(yáng)性克隆，取100μl送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全正確后再接種進(jìn)行質(zhì)粒抽提。

1.2.2 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro及空載對(duì)照質(zhì)粒pSB53-L.V的制備 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胚腎上皮293T細(xì)胞常規(guī)消化重懸成單個(gè)細(xì)胞，提前1 d按照2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種到6孔板中。按慢病毒包裝試劑盒說(shuō)明書對(duì)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLVX-EGFP-3FLAGPuro和空載對(duì)照質(zhì)粒pSB53-L.V進(jìn)行包裝，常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集上清液，置于4°C、1 200 r/min離心10min，過(guò)濾后，置于4°C、1 500 r/min離心4 h進(jìn)行濃縮。藥篩法測(cè)定慢病毒的滴度。

1.2.3 慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌MHCC97H細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)前1 d將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌MHCC97H細(xì)胞按照5×104個(gè)細(xì)胞/孔鋪在24孔板中，分別加入慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro和空載對(duì)照質(zhì)粒pSB53-L.V病毒液和終質(zhì)量濃度為5μg/ml的聚凝胺。培養(yǎng)24 h后更換新鮮的10%FBSDMEM，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。21 d后拍攝熒光照片，不攜帶紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞命名為慢病毒Cat S-MHCC97H細(xì)胞組，攜帶少數(shù)紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞命名為空載對(duì)照Mock-MHCC97H細(xì)胞組。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)Cat SmRNA的表達(dá)情況 按invitrogene Trizol說(shuō)明書提取 pLVX-EGFP-3FLAGPuro組和空載對(duì)照pSB53-L.V組細(xì)胞總 RNA，以cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。PCR引物：Cat S上游引物為5′-GCCTGATTCTGTGGACTGG-3′，下游引物為5′-GATGTACTGGAAAGCCGTTGT-3′；GAPDH上游引物為5′-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3′，下游引物為5′-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3′。qRT-PCR循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95℃15 s，每一步變性95℃5 s，退火延伸60℃30 s，共45個(gè)循環(huán)。每組重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值，數(shù)據(jù)分析采用RT-PCR儀的Opticon-MonitorTMAnalysis軟件完成。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)Cat S蛋白和MMP-2蛋白的表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的Cat SMHCC97H細(xì)胞和對(duì)照Mock-MHCC97H細(xì)胞，按照4×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板中，24 h后離心收集細(xì)胞、裂解，4°C、12 000 r/min離心10min，去沉淀收集上清液。BCA試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，制作蛋白樣品。利用10%分離膠進(jìn)行電泳，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA室溫下封閉1 h，然后分別加入Anti-Cat S抗體（1∶1 000）、Anti-MMP-2抗體（1∶1 000）和Anti-βactin抗體（1∶10 000），4°C過(guò)夜。用1×TBST洗膜3×10min后分別加入鼠二抗或者兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h，1×TBST洗膜3×10min后加入適量發(fā)光液，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄蛋白條帶結(jié)果。

1.2.6 MTT實(shí)驗(yàn)觀察CatS基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別消化Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后取1×103個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔板中，各接種8塊板。每隔24 h隨機(jī)取1塊板，每孔加入10μlMTT溶液（10mg/ml），常規(guī)培養(yǎng)4 h后，每孔加入150μl的DMSO，振蕩5 min，置于多功能酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察 Cat S基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H細(xì)胞遷移的影響 取生長(zhǎng)良好的Cat SMHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，分別以5×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，細(xì)胞長(zhǎng)至飽和狀態(tài)后，用無(wú)菌Tip頭劃出無(wú)細(xì)胞痕，然后加入含有8μg/ml的絲裂霉素C、無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基1 m l。常規(guī)培養(yǎng)24 h后顯微鏡下觀察相同位置細(xì)胞的遷移情況。1.2.8 Transwell小室趨化實(shí)驗(yàn)觀察Cat S基因過(guò)表達(dá)對(duì)肝癌MHCC97H細(xì)胞遷移的影響 取生長(zhǎng)良好的Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞，分別以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于Transwell小室的上室，加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)，下室加入500μl 20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，甲醇固定5 min，結(jié)晶紫染色5 min，小室在倒置顯微鏡下隨機(jī)選擇中央及四周8個(gè)視野（×100），計(jì)數(shù)每個(gè)視野穿過(guò)微孔膜的細(xì)胞數(shù)目。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro酶切鑒定

慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro用EcoR和Xba I進(jìn)行雙酶切，切去EGFP-3FLAG片段（810 bp），酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后回收約8.1 kb的載體片段，與預(yù)計(jì)結(jié)果符合，證明載體構(gòu)建成功。見(jiàn)圖1。

2.2 雙酶切獲得目的基因片段

化學(xué)合成的Cat S目的基因用EcoR I和Xba I對(duì)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳后回收約1 kb的目的基因片段。與預(yù)計(jì)結(jié)果符合，證明目的基因合成正確。酶切圖譜見(jiàn)圖2。

2.3 陽(yáng)性克隆鑒定

挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子，重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，再?gòu)闹腥〕?μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽(yáng)性克隆得到1 256 bp的片斷，陰性克隆得到1 058 bp的片斷。菌落PCR鑒定見(jiàn)圖3。接種陽(yáng)性克隆，取其中100μl送測(cè)序。陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果和預(yù)期的序列完全一致。

圖1 慢病毒載體pLVX-EGFP-3FLAG-Puro的鑒定

圖2 酶切獲得目的基因片段

圖3 陽(yáng)性菌落PCR鑒定圖

2.4 慢病毒感染肝癌MHCC97H細(xì)胞

藥篩法測(cè)定慢病毒滴度為2×108（TU/ml），將慢病毒pLVX-EGFP-3FLAG-Puro和空載對(duì)照質(zhì)粒pSB53-L.V感染肝癌MHCC97H細(xì)胞21 d后拍攝熒光照片。Cat S-MHCC97H細(xì)胞不攜帶紅色熒光標(biāo)記，空載對(duì)照Mock-MHCC97H細(xì)胞攜帶少量的熒光。見(jiàn)圖4。

2.5 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat SmRNA的表達(dá)

慢病毒轉(zhuǎn)染肝癌MHCC97H細(xì)胞后，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞中Cat SmRNA的表達(dá)量明顯高于Mock-MHCC97H細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

圖4 熒光顯微鏡觀察慢病毒感染21d后的肝癌MHCC97H細(xì)胞（×200）

圖5 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat Sm RNA的相對(duì)表達(dá)量

2.6 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat S蛋白的表達(dá)

慢病毒感染后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Cat SMHCC97H細(xì)胞CatS蛋白的表達(dá)量較Mock-MHCC97H細(xì)胞增加，約為Mock-MHCC97H細(xì)胞的2倍。此外，Cat S-MHCC97H細(xì)胞中MMP-蛋白的表達(dá)量也明顯高于Mock-MHCC97H細(xì)胞。見(jiàn)圖6。

圖6 肝癌MHCC97H細(xì)胞中Cat S蛋白和MMP-2蛋白的表達(dá)

2.7 Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，第4天Cat S-MHCC97H細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較Mock-MHCC97H細(xì)胞明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示過(guò)表達(dá)Cat S基因可增強(qiáng)肝癌MHCC97H細(xì)胞的生長(zhǎng)活性。見(jiàn)圖7。

圖7 過(guò)表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖能力的影響

2.8 CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響

常規(guī)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞的遷移率分別為（22±1.1）%和（18±1.4）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示Cat S基因過(guò)表達(dá)后能明顯促進(jìn)Cat S-MHCC97H細(xì)胞遷移。見(jiàn)圖8。

2.9 Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cat S-MHCC97H細(xì)胞和Mock-MHCC97H細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的細(xì)胞數(shù)分別為（87±5.9）個(gè)和（32±4.6）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示過(guò)表達(dá)Cat S基因后肝癌MHCC97H細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力增強(qiáng)。見(jiàn)圖9。

圖8 過(guò)表達(dá)CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

圖9 過(guò)表達(dá)CatS基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞遷移能力的影響（×100）

3 討論

組織蛋白酶屬于同源性蛋白酶，在多種細(xì)胞中均有表達(dá)［13］。Cat S基因作為組織蛋白酶家族（Cat B、C、F、H、K、L、O、S、V、W和X）的成員之一，通常位于溶酶體內(nèi)，被激活后分泌到細(xì)胞表面，然后進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［14，15］。Flannery等［7］用免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，Cat S基因在人星形細(xì)胞瘤中高表達(dá)，而且與腫瘤的進(jìn)展程度相關(guān)，在Ⅳ期腫瘤中表達(dá)量最高，但在正常星形細(xì)胞中未見(jiàn)表達(dá)。許多研究亦證實(shí)Cat S基因參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡［16］，誘導(dǎo)內(nèi)皮生長(zhǎng)因子釋放，促進(jìn)新生血管生成等［15］，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。然而，Cat S基因在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制尚未清楚。慢病毒載體由于可穩(wěn)定地將目的基因整合到宿主基因組中，并長(zhǎng)期地表達(dá)該目的基因而被用于基因治療。隨著相關(guān)技術(shù)不斷發(fā)展、進(jìn)步，目前應(yīng)用慢病毒技術(shù)不僅可上調(diào)基因表達(dá)，還可從基因組水平研究基因功能。為此，本研究利用慢病毒載體作基礎(chǔ)，將Cat S基因的編碼區(qū)域克隆于慢病毒載體，成功建立了過(guò)表達(dá)Cat S基因肝癌細(xì)胞，為后續(xù)研究Cat S基因功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

肝癌是世界范圍內(nèi)死亡率較高的常見(jiàn)惡性腫瘤，但目前對(duì)其尚無(wú)有效的治療措施，主要是因?yàn)楦鞣N療法均未能很好地解決腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問(wèn)題，進(jìn)而極大影響了其臨床療效。隨著人們對(duì)肝癌機(jī)制的研究不斷深入以及分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，肝癌的基因治療成為繼手術(shù)、放化療及介入治療之后的一種新型治療方法，因此，尋找肝癌治療有效的靶點(diǎn)，尤其是與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感靶基因?qū)μ岣吒伟┡R床療效至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，肝癌MHCC97H細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cat S基因后，明顯促進(jìn)了癌細(xì)胞增殖和侵襲，與我們前期的研究結(jié)論一致。提示Cat S基因可能在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可能是治療肝癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

最近研究表明蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的選擇具有重要作用［17］。Palermo等［18］認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs），包括基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）是腫瘤研究領(lǐng)域的重點(diǎn)內(nèi)容之一。MMPs主要通過(guò)降解的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）促進(jìn)腫瘤侵襲［19］。MMP-2可以降解腫瘤血管的基底膜，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、遷移，與肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移亦密切相關(guān)［20，21］。進(jìn)一步研究顯示，組織蛋白酶通過(guò)降解ECM促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成［22］。有報(bào)道稱Cat S參與了降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，如彈性蛋白、纖維粘連蛋白、層粘連蛋白和膠原蛋白［15，23］及MMP-2［24］。本研究觀察了肝癌MHCC97H細(xì)胞過(guò)表達(dá)Cat S基因后MMP-2蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)Cat S基因能顯著增加肝癌MHCC97H細(xì)胞中MMP-2蛋白的表達(dá)，推測(cè)Cat S基因過(guò)表達(dá)可使肝癌細(xì)胞MMP-2蛋白的表達(dá)量升高，從而促進(jìn)肝癌MHCC97H細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，有關(guān)方面有待進(jìn)一步深入研究。

隨著對(duì)肝癌自然病程與生物學(xué)特性的認(rèn)識(shí)不斷深入以及目前臨床上各種治療方法的優(yōu)化和聯(lián)合應(yīng)用，肝癌的治療理念和策略將發(fā)生深刻轉(zhuǎn)變，而分子靶向治療異常改變的基因，將在肝癌臨床治療中具有良好的發(fā)展前景。本研究認(rèn)為過(guò)表達(dá)Cat S基因?qū)Ω伟㎝HCC97H細(xì)胞增殖和侵襲具有促進(jìn)作用，其分子生物學(xué)機(jī)制可能與MMP-2蛋白的表達(dá)有關(guān)，提示CatS基因可能成為治療肝癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，這為促進(jìn)肝癌基因治療及進(jìn)一步闡明肝癌增殖和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供新的思路。

［1］ Pa r k i n D M，B r a y F，F(xiàn) e r l a y J，et a l.G lob a l c an ce r st a t i st i cs，2002［J］. C A C an ce r J C l i n，2005，55（2）：74-108.

［2］ Jem a l A，Mu rr a y T，W a r d E，et a l.C an ce r st a t i st i cs，2005［J］.C A C an ce r J C l i n，2005，55（1）：10-30.

［3］ S m i t h R A，C okk i n i des V，E y r e H.A me ri c an C an ce r S oc i ety g u i del i n es fo r t h e e a r ly detect i o n of c an ce r，2006［J］.C A C an ce r J C l i n. 2006，56（1）：11-25，49-50.

［4］ C a b r e r a R，N elso n D R.R ev i ew a r t i cle：t h e m ana g eme n t of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.A l i me n t Pha r m a col T h e r，2010，31（4）：461-476.

［5］ L lovet J M，Bu rr o u g h s A，B r u i x J.H ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］. L an cet，2003，362（9399）：1907-1917.

［6］ B r u i x J，Llovet J M.Ma jo r a c h i eveme n ts i n h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.L an cet，2009，373（9664）：614-616.

［7］ F l ann e r y T，Gi bso n D，M ir a k hu r M，et a l.T h e cl i n i c a l s ig n i f i c an ce of c a t h eps i n S exp r ess i o n i n hu m an a st r ocytom a s［J］.A m J Pa t h ol，2003，163（1）：175-182.

［8］ K os J，S ek ir n i k A，K op i t a r G，et a l.C a t h eps i n S i n t u mo u r s，r e gi o na l lymp h n odes an d se r a of p a t i e n ts w i t h l un g c an ce r：r el a t i o n to p r o gn os i s［J］.B r J C an ce r，2001，85（8）：1193-1200.

［9］ L i n d ah l C，Si mo n sso n M，B e rg h A，et a l.I n c r e a sed levels ofm a c r op ha g esec r eted c a t h eps i n S d u ri n g p r ost a te c an ce r p r o gr ess i o n i n T R A MP m i ce an d p a t i e n ts［J］.C an ce r G e n om i cs P r oteom i cs，2009，6（3）：149-159.

［10］ Y an g Y，L i m S K，C h oo n g LY，et a l.C a t h eps i n S med i a tes g a st ri c c an ce r cellm igr a t i o n an d i n v a s i o n v i a a p u t a t i ve n etwo r k ofmet a st as i s-a ssoc i a ted p r ote i n s［J］.J P r oteome R es，2010，9（9）：4767-4778.

［11］G oc h ev a V，Z e n g W，K e D，et a l.D i st i n ct r oles fo r cyste i n e c a t h eps i n g e n es i n m u lt i st a g e t u mo rig e n es i s［J］.G e n es D ev，2006，20（5）：543-556.

［12］ Xu J，L i D，K e Z，et a l.C a t h eps i n S i s a be rr an tly ove r exp r essed i n hu m an h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.M ol M ed R ep，2009，2（5）：713-718.

［13］C ha pm an H A，R i ese R J，S h iG P.E me rgi n g r oles fo r cyste i n e p r ote a ses i n hu m an b i olo g y［J］.A nnu R ev Ph ys i ol，1997，5963-5988.

［14］Lev i c a r N，S t r oj n i k T，K os J，et a l.Lysosom a l e nz ymes，c a t h eps i n s i n b r a i n t u mo u r i n v a s i o n［J］.J N e u r oo n col，2002，58（1）：21-32.

［15］W an g B，S un J，K i t a moto S，et a l.C a t h eps i n S co n t r ols an gi o g e n es i s an d t u mo rgr owt h v i a m a t ri x-de ri ved an gi o g e n i c f a cto r s［J］.J B i ol C h em，2006，281（9）：6020-6029.

［16］T u r k B，S tok a V，R o z m an-Pun g e r c a r J，et a l.A poptot i c p a t h w a ys：i nvolveme n t of lysosom a l p r ote a ses［J］.B i ol C h em，2002，383（7-8）：1035-1044.

［17］L i m SO，Pa r k S J，K i m W，et a l.P r oteome ana lys i s of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.B i oc h em B i op h ys R es C omm un，2002，291（4）：1031-1037.

［18］Pa le r mo C，Joyce J A.C yste i n e c a t h eps i n p r ote a ses a s p ha r m a colo gi c a l t a rg ets i n c an ce r［J］.T r e n ds Pha r m a col S c i，2008，29（1）：22-28.

［19］ S p an o D，Z ollo M.T u mo r m i c r oe n v ir o n me n t：a m a i n a cto r i n t h e met a st a s i s p r ocess［J］.C l i n E xp M et a st a s i s，2012，29（4）：381-395.

［20］ Bu W，Huan g X，T an g Z.T h e r ole of MMP-2 i n t h e i n v a s i o n an d met a st a s i s of h ep a tocell u l a r c a r c i n om a（H CC）［J］.Zh o n g hua Y i Xu e Za Zh i，1997，77（9）：661-664.

［21］Ye h H C，L i n S M，C h e n M F，et a l.E v a l ua t i o n of se r u m m a t ri xmet a llop r ote i na se MMP-9 to MMP-2 r a t i o a s a b i om a r ke r i n h ep a tocell u l a r c a r c i n om a［J］.H ep a to g a st r oe n te r olo g y，2010，57（97）：98-102.

［22］F u Y G，S un g JJ，W u KC，et a l.I nh i b i t i o n of g a st ri c c an ce r-a ssoc i a ted an gi o g e n es i sby an t i se n se C O X-2 t r an sfect an ts［J］.C an ce r Lett，2005，224（2）：243-252.

［23］Bu r de n R E，G o r mley J A，J a q u i n T J，et a l.A n t i body-med i a ted i nh i b it i o n ofc a t h eps i n S blockscolo r ect a l t u mo r i n v a s i o n an d an gi o g e n es i s［J］. C l i n C an ce r R es，2009，15（19）：6042-6051.

［24］S eve n i c h L，S c hu rig t U，S a c h se K，et a l.S y n e rgi st i c an t i t u mo r effects ofcomb i n ed c a t h eps i n B an d c a t h eps i n Z def i c i e n c i eso n b r e a stc an ce r p r o gr ess i o nan dmet a st a s i s i n m i ce［J］.P r oc N a tl A c a d S c i U SA，2010，107（6）：2497-2502.

［2015-03-23收稿］［2015-05-25修回］［編輯 羅惠予］

Effects of lentivirus-mediated overexpression of Cat S gene on proliferation and m igration of hepatocellular carcinoma cellMHCC97H

ZHANG Zhi，ZHU Guangzhi，PENG Tao，ZHAO Guoliang，XU Jing（Department of Hepatobiliary Surgery，The First Affiliated Hospital of GuangxiMedical University，Nanning 530021，P.R.China）

XU Jing.E-mail：jxuapr@aliyun.com

Objective To construct a lentivirus expression vector to drive stable Cat S overexpression in the hepatocellular carcinoma（HCC）cell line MHCC97H，and to investigate the effects of overexpression on cell proliferation and migration.M ethods The Cat S gene was inserted into the lentiviral expression vector pLVX-EGFP-3FLAG-Puro using Age I and EcoR I restriction enzymes and transfected into 293T cells to generate recombinant lentivirus.This virus was used to infect MHCC97H cells，and positive cells were selected using puromycin.Real-time quantitative PCR，Western blots，MTT assay，the transwellmigration assay and the wound healing migration assay were used to assess the effects of Cat S overexpression on proliferation and migration of MHCC97H cells.Results A lentiviral vector containing the Cat S gene was constructed，and an MHCC97H cell line stably overexpressing Cat Swas established. Cat Soverexpression was associated with significantly shorter cell doubling time，aswell as significantly greater invasion and migration abilities.Conclusions Lentivirus-mediated Cat Soverexpression can increase MHCC97H proliferationand migration，opening the doorto future studies ofmolecularmechanisms of liver cancer invasion and metastasis.

Liver neoplasm；Cathepsin S；Overexpression；Lentivirus infections；Proliferation；Migration

R735.7

A

1674-5671（2015）04-07

10.3969/j.issn.1674-5671.2015.04.02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81360372）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011GXNSFA018284）；廣西衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（GZKZ10-114）

徐靜。E-mail：jxuapr@aliyun.com