發(fā)掘與篩選食品中沙門氏菌分子檢測(cè)靶點(diǎn)

高穎

摘要：目的：分析食品中沙門氏菌分子檢測(cè)靶點(diǎn)的篩選與發(fā)掘。方法：利用BLAST技術(shù)對(duì)食品中的沙門氏菌屬具有特異性的DNA片段進(jìn)行選擇，并對(duì)其進(jìn)行隨機(jī)選擇，挑選其中的15個(gè)作為靶點(diǎn)，并用27對(duì)引物對(duì)該靶點(diǎn)的特異性、靈敏度加以評(píng)價(jià)，并從中選擇出具有最佳檢測(cè)性的引物。結(jié)果：經(jīng)過(guò)對(duì)27對(duì)引物檢測(cè)性的分析，發(fā)現(xiàn)其中檢測(cè)性最好的是FS23，采用這一對(duì)引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在44株沙門氏菌中能夠擴(kuò)增出492的特異性片段，而在其余非沙門氏菌株實(shí)驗(yàn)中無(wú)法擴(kuò)增特異性片段，以此作為引物檢測(cè)沙門氏菌的林敏性達(dá)到了11.9，對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到了4.9。對(duì)被沙門氏菌污染的牛奶進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)其菌落濃度在100時(shí)，只需要5h時(shí)的時(shí)間即可以檢測(cè)出沙門氏菌。結(jié)論：利用引物FS23對(duì)沙門氏菌能夠進(jìn)行有效的檢測(cè)，并且其具有較高的特異性和靈敏性，是目前應(yīng)用比較廣泛的檢測(cè)靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌 PCR技術(shù) 靶點(diǎn) 篩選 評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：TS207.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-5336（2015）02-0026-01

沙門氏菌是一類在自然界中存在數(shù)量較大的致病性細(xì)菌，根據(jù)國(guó)際上的統(tǒng)計(jì)，因食用被沙門氏菌造成食物中毒的情況非常多，占據(jù)了食物中毒中的首位。并且因沙門氏菌能夠給人們帶來(lái)兩大類疾病，其中包括傷寒類疾病和急性胃腸道炎癥等。一般情況下，在肉類食品、奶制品以及蛋制品中出現(xiàn)沙門氏菌污染的情況較多，而這些均是人們?nèi)粘Ｉ钪惺秤幂^多的食品種類，因此，必須要加大對(duì)食品致病菌安全檢測(cè)工作的力度，尋找更加敏感和準(zhǔn)確的沙門氏菌檢測(cè)劑。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本次實(shí)驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)儀器主要包括DNA聚合酶、即用型DNA分子100bp，PCR擴(kuò)增儀，紫外核酸和蛋白質(zhì)分析儀、電泳儀等，實(shí)驗(yàn)材料為44株沙門氏菌和22株非沙門氏菌，其均是嚴(yán)格按照我國(guó)相關(guān)細(xì)菌培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)出的菌株樣品。

1.2 PCR技術(shù)的應(yīng)用

首先對(duì)本次實(shí)驗(yàn)中的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找相關(guān)沙門氏菌和其它菌株的基因整體序列，將其進(jìn)行對(duì)比，尋找沙門氏菌中具有特異性的DNA片段，然后再隨機(jī)從中選出15個(gè)片段，利用Primer Permier5.0系統(tǒng)對(duì)引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。一共設(shè)計(jì)27對(duì)引物，將其標(biāo)記為-。另外選擇實(shí)際工作中被應(yīng)用與檢測(cè)沙門氏菌的其它引物進(jìn)行對(duì)比。其次，利用PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行相關(guān)反應(yīng)，將體系設(shè)定為25，循環(huán)參數(shù)設(shè)定為94℃3min、94℃30s、60攝氏度30s、72℃30s，以此進(jìn)行共35個(gè)循環(huán)實(shí)驗(yàn)，最后利用72℃的實(shí)驗(yàn)溫度，進(jìn)行10min的反應(yīng)，然后將反應(yīng)后的產(chǎn)物利用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用凝膠成像儀觀察電泳效果。

1.3 引物特異性的評(píng)價(jià)方法

從44株沙門氏菌和22株非沙門氏菌中提取的DNA靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，利用PCR擴(kuò)增儀建立反應(yīng)體系，并利用各組引物對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，同時(shí)將對(duì)照引物進(jìn)行反應(yīng)，以此作為對(duì)照數(shù)據(jù)。

1.4 引物靈敏度的評(píng)價(jià)方法

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)特異性較好的引物進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，將其與純細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行反應(yīng)，并以對(duì)照組引物進(jìn)行對(duì)比。其具體方法為：從沙門氏菌的基因組中踢出去一定的基因組，并將其進(jìn)行10倍的稀釋，沒(méi)進(jìn)行1倍稀釋劑提取5的樣品進(jìn)行PCR的擴(kuò)增處理。而對(duì)于靈敏度的評(píng)價(jià)則是將純沙門氏菌培養(yǎng)物進(jìn)行為期6h的培養(yǎng)，然后同樣進(jìn)行10倍的稀釋，并分別選擇稀釋6、7、8倍時(shí)的樣品，將其提取稀釋后的樣品各5進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 污染食品樣本的檢驗(yàn)方法

在本次實(shí)驗(yàn)中，選擇的污染食品樣本為含有沙門氏菌的牛奶飲品，共取10分牛奶飲品樣品，每份樣品劑量為25mL，將其分別接種不同量的沙門氏菌種，分別為0、5、10、20、100cfu，每種個(gè)兩份，隨后將其轉(zhuǎn)移入緩沖蛋白胨中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)的溫度設(shè)定為37℃，并且在150r/min的離心狀態(tài)下培養(yǎng)12h，期間每隔1h提取1mL的樣品，將其中的DNA基因組提取出，進(jìn)行PCR擴(kuò)增處理。

2 結(jié)果

經(jīng)過(guò)對(duì)27對(duì)引物檢測(cè)性的分析，發(fā)現(xiàn)其中檢測(cè)性最好的是FS23，采用這一對(duì)引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在44株沙門氏菌中能夠擴(kuò)增出492的特異性片段，而在其余非沙門氏菌株實(shí)驗(yàn)中無(wú)法擴(kuò)增特異性片段，以此作為引物檢測(cè)沙門氏菌的林敏性達(dá)到了11.9，對(duì)于細(xì)菌純培養(yǎng)物的靈敏度達(dá)到了4.9。對(duì)被沙門氏菌污染的牛奶進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)其菌落濃度在100時(shí)，只需要5h時(shí)的時(shí)間即可以檢測(cè)出沙門氏菌。

3 討論

PCR技術(shù)是一種能夠進(jìn)行靶點(diǎn)檢測(cè)和引物敏感性、特異性檢測(cè)的重要技術(shù)，其在現(xiàn)代食品安全檢測(cè)工作中的應(yīng)用十分廣泛。而對(duì)于引物來(lái)說(shuō)，其能夠被應(yīng)用在PCR檢測(cè)過(guò)程中，其最大的關(guān)鍵在于引物本身的特異性，因此在本次實(shí)驗(yàn)當(dāng)中首先對(duì)相關(guān)引物進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中FS23的特異性最佳，并以其為中心進(jìn)行了后續(xù)研究，了解了這種引物在對(duì)沙門氏菌檢測(cè)上的特異性和靈敏性。

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