1HPLCMS定性定量檢測清腦保心康膠囊中非法添加的硝苯地平

葉丹怡　朱敏

摘要：目的：建立HPLC/MS方法，快速定性定量檢測保健食品中非法添加的硝苯地平。方法：采用高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀。色譜條件：Agilent Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm）色譜柱。柱溫：30OC。流動相：乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29。流速為0.6mL/min。質(zhì)譜條件：ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。以保留時間及定性離子對之間的相對豐度定性。以定量離子對峰面積定量。結(jié)果：硝苯地平在1.083～108.3ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r>0.9998）。平均加樣回收率：99.44%。定量限為216.6pg 結(jié)論：本方法定性可靠、定量準確，且快速簡便。可用于保健食品中非法添加硝苯地平的檢測。

關(guān)鍵詞：硝苯地平 非法添加 定性 定量 HPLC/MS

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1672-5336（2015）02-0011-02

硝苯地平是第一代鈣拮抗劑，為抗高血壓、防治心絞痛藥物，適用于各種類型的高血壓，對頑固性、重度高血壓也有較好療效，是20世紀80年代中期世界暢銷的藥物之一。該藥的特點是：起效快，峰/谷比值高，導致了神經(jīng)體液活化，經(jīng)多年臨床使用，該藥的療效得到了肯定。硝苯地平在價格上也占據(jù)了強有力的優(yōu)勢。但藥效時間短，血壓波動大，尚有負性肌力和負性傳導作用，增加冠心病患者的死亡率[1]。一些不法商販，在一些宣稱具有降壓療效的保健食品中非法添加使用，由于非法添加的化學藥物，劑量上無從把握，有些患者在不知情的情況下使用，無意中增加了風險性，造成不良反應(yīng)，嚴重的更是威脅自己的生命[2]，所以，急需對此類非法添加行為建立檢驗檢測方法，嚴厲打擊。之前已有不少研究者用不同的一起監(jiān)測中成藥制劑中添加降壓藥物此保健品已報道的只有樊磊磊等的定量檢測非法添加物利血平，因懷疑其中不止混有利血平，還有其他降壓化學藥品，本文采用超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀，檢測出其還混有硝苯地平，并進行首次定性定量同步檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6460 安捷倫公司）；色譜柱Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） （安捷倫公司）；濾膜0.8μm（上海半島實業(yè)有限公司凈化器材廠）；SK5210HO超聲清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）；BT124S電子分析天平（北京賽多利斯公司）；BP211D電子分析天平（北京賽多利斯公司）。硝苯地平對照品（供含量測定用，批號：100338-200502中國藥品生物制品檢定所），清腦保心康膠囊（國藥準字Z20002158 藥品安全專項整治行動送檢樣品）；乙腈；甲醇均為色譜純（Merck公司），水為超純水。

1.2 HPLC/MS條件

HPLC條件：色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6mm×100mm，3.5μm） ，柱溫：30OC，進樣量：2μl，乙腈：0.2%甲酸水溶液=71：29；流速：0.6mL/min。MS條件：ESI源（+），毛細管電壓：3.5kV，離子源溫度：100，干燥氣溫度：350 OC，干燥氣流速：10L/min，霧化器壓力：50psi。監(jiān)測方式：MRM，監(jiān)測離子對（m/z）：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1。

1.3 對照品溶液的制備

避光條件下， 精密稱取硝苯地平標準對照品10.83mg，置棕色容量瓶中，加甲醇定量稀釋制成濃度為10.83ug/L的標準貯備液，2～8℃冷藏保存，備用。

1.4 供試品溶液的制備

避光條件下，取樣品內(nèi)容物適量，混勻后，取一次性服用量樣品（4粒，約1g），精密稱定后，置50ml容量瓶中，加甲醇40ml，超聲處理15min，冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，稀釋2000倍后，過0.8μm微孔濾膜，即得[3]。

1.5 空白溶液制備

直接取稀釋溶劑即得。

2 結(jié)果

2.1 定性分析

取標準貯備液，稀釋制成216.6ng/ml的對照品溶液，進樣2μl，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖。統(tǒng)計并分析對照品溶液所得圖譜中硝苯地平的色譜保留時間（RT=2.6min）及定性離子碎片存在有（m/z：347.1>315.1；347.1>254.1；347.1>195.1；347.1>194.1）。見圖1。

取供試品溶液，進樣2μl，記錄所得質(zhì)譜MRM色譜圖。統(tǒng)計并分析供試品溶液蘇哦的圖譜，如檢測硝苯地平的質(zhì)譜MRM離子通道中有色譜峰出現(xiàn)，先與對照品中峰的保留時間對比（供試品峰RT=2.6min的±2.5%允許誤差范圍內(nèi)），此一致，再對比定性離子碎片是否跟對照品一致，也一致，如判斷供試品溶液中含有此化學藥品。見圖2。

2.2 定量分析

對判定供試品溶液中含有硝苯地平的供試品，則按其定量離子對（m/z）：347.1>315.1的峰面積進行含量計算。含量測定方法研究如下：

（1）線性考察和定量限配制系列濃度的對照品溶液，進樣測定，以濃度為橫坐標，以離子對的峰面積為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果表明硝苯地平在1.083～108.3ng/ml范圍內(nèi)線性方程為Y=43.673782X-2.777850（r=0.9999），呈良好的線性關(guān)系，進樣量為2μl，硝苯地平的定量限為216.6pg。

（2）精密度試驗取對照品溶液1份，連續(xù)進樣6次，硝苯地平定量離子對峰面積的RSD為1.68%。

（3）重復性試驗取此陽性樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，依次進樣測定。硝苯地平含量的RSD為：1.26%。

（4）穩(wěn)定性試驗取2.2.3重復性試驗項下所制備的同一供試品溶液，分別在2、4、8、16h，進樣測定，結(jié)果硝苯地平的峰面積RSD為1.18%，表明供試品溶液在制備后的16h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（5）回收率試驗取一次性服用量的陽性樣品6份，分別置于50ml容量瓶中，各精密加入10.83ug/ml的標準貯備液甲醇2.5ml，超聲處理15min，冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，稀釋2000倍后，過0.8μm微孔濾膜，進行測定。平均回收率為：99.44%，RSD為：0.94%。見表1。

（6） 樣品測定取供試品溶液，進樣測定，以所監(jiān)測的MRM色譜圖中定量離子對（m/z）：347.1>315.1的峰面積計算，樣品中含硝苯地平：5.1mg/g。

2.3 討論

在試驗中選擇流動相時，曾比較過液質(zhì)聯(lián)用儀常用到的乙腈-水溶液、乙腈-0.2%甲酸的水溶液，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.2%甲酸的水溶液作為流動相，所得的硝苯地平的離子信號明顯增強，這與其結(jié)構(gòu)中所含的帶N的堿性基團，在酸性條件下有利于其離子化有關(guān)。

3 結(jié)語

清腦保心康膠囊以具有降壓功效的純中藥制劑保健食品的形式，非法添加化學藥品硝苯地平銷售，其成分復雜，干擾因素較多，采用其他檢測方法難度頗大，但采用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜MRM監(jiān)測方式，選擇性好，并能有效排除其他干擾，無需對樣品進行復雜的前處理，避免了因前處理可能帶來的誤差，采用相對保留時間及離子碎片進行定性，定性結(jié)果更為準確，且靈敏度也極高。采用HPLC分析樣品，在3min內(nèi)即可完成樣品的檢測，兩者結(jié)合輕易實現(xiàn)了快速的定性定量監(jiān)測，故此，HPLC/MS法明顯優(yōu)于簡單的HPLC法[4]。

參考文獻

[1]王玲.高血壓病降壓藥物的合理應(yīng)用[J]廣西中醫(yī)學院學報，2000，17（1）：55-56.

[2]周蘭坤.談降壓藥物的不良反應(yīng)[J]中外醫(yī)療，2009，29（15）：90.

[3]劉吉金.降壓保健品及中成藥中非法添加化學成分的快速檢測方法研究[J]中成藥，2008，30（1）：144.

[4]劉吉金，楊敏，李軍等.HPLC同時檢測保健品及中成藥中非法添加9種抗高血壓化學藥物的研究[J]中國現(xiàn)在應(yīng)用藥學雜志，2008，25（8）：717.