生脈注射液質(zhì)量分析與熱原控制探討

唐健新

【摘要】目的：對國家食品藥品監(jiān)督管理局公告的蘇中藥業(yè)的生脈注射液（批號：14081413）進行全面檢測，探索引起不良反應(yīng)的原因。方法：按照生脈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進行全面檢測。結(jié)果：熱原存在批內(nèi)差異，不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。結(jié)論：建議企業(yè)擴大批內(nèi)批間檢查批次，確保臨床用藥安全。

【關(guān)鍵詞】 生脈注射液；熱原；質(zhì)量分析

【中圖分類號】R284.1 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2015）19-0029-03

生脈注射液是根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典古方“生脈散”研制而成的中藥注射液，由紅參、麥冬、五味子組成，收載于2009 年版國家基本藥物目錄。具有理氣開竅、益氣強心、生津復(fù)脈、回陽救逆、扶正祛邪、活血化瘀、抗凝等功效[1]，臨床用于治療冠心病，心肌梗死，心功能衰竭，各種休克及腫瘤患者化療的輔助治療?，F(xiàn)行生脈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》（ WS3-B-2865-98-2011）。該藥于1983年由華西藥業(yè)首家上市，1995年經(jīng)國家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)為“必備急救中藥”，目前全國共有8家企業(yè)生產(chǎn)[2-4]。但生脈注射液在2007年即列為國家食藥監(jiān)“中藥注射劑高風(fēng)險品種名單”，2012年國家食藥監(jiān)發(fā)布過《藥品不良反應(yīng)信息通報》提示生脈注射液存在嚴(yán)重過敏反應(yīng)現(xiàn)象。2004～2011年間國家藥品不良反應(yīng)監(jiān)測中心共收到生脈注射液嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件病例報告508例[5-7]。

生脈注射液在臨床上會產(chǎn)生“過敏樣反應(yīng)”，嚴(yán)重者可導(dǎo)致其體克甚至死亡。國家食品藥品監(jiān)督管理局于2015年4月24日公告蘇中藥業(yè)的生脈注射液（批號：14081413）個別患者用藥后出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱癥狀的質(zhì)量問題[8]。實驗根據(jù)《國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》（ WS3-B-2865-98-2011）對生脈注射液（批號：14081413）進行全面分析，探討生脈注射液熱源不合格的判斷依據(jù)及引起不良反應(yīng)的原因，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC2010-A系列高效液相色譜儀。

1.2 材料 人參皂苷Rb1對照品、Re對照品、Rgl對照品、麥冬對照藥材；五味子對照藥材；五味子醇甲對照品（以上材料均由中國藥品生物制品檢定所提供）；生脈注射液（批號：14081413，江蘇蘇中藥業(yè)）樣品抽自普寧市里湖鎮(zhèn)中心衛(wèi)生院。標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（默克公司）試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定應(yīng)本品為淡黃色或淡黃棕色的澄明液體，對該批樣品進行觀察發(fā)現(xiàn)該批樣品為淡黃色的澄明液體，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.2 薄層鑒別

2.2.1 人參皂苷Rb1、Re、Rgl的薄層鑒別 取生脈注射液約10ml，置水浴上蒸干，殘渣加2ml乙醇使溶解，作為供試品溶液。另分別取人參皂苷Rb1、Re、Rgl對照品適量，加乙醇制成2mg/ml的混合溶液，作為對照品溶液。按照2010年版《中國藥典》薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各2μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，在溫度為20℃，濕度為65%的條件下，以三氯甲烷-甲醇-水（75∶20∶2）為展開劑展開，取出，晾干；噴10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色淸晰，置紫外光燈（365nm）下檢視，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，人參皂苷Rb1、Re和Rgl混合對照的分離度良好，斑點清晰，并與生脈注射液樣品在相同位置上顯示相同顏色的斑點。符合《中國藥典》規(guī)定的要求。

2.2.2 麥冬薄層鑒別 取本品40ml，加鹽酸3ml，置水浴中加熱1小時，放冷，加乙醚30ml振搖提取，分取乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷l ml使溶解，作為供試品溶液。另取麥冬對照藥材2g，加水煎煮30分鐘，濾過，濾液濃縮至約40ml，同法制成對照藥材溶液。按照2010年版《中國藥典》薄層色譜法試驗，分別吸取上述溶液各5μ1，分別點于同一硅膠G薄層板上，在溫度為20℃，濕度為65%的條件下，以三氯甲烷-丙酮（4∶1）為展開劑展開，取出，晾干；噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，麥冬對照藥材的斑點清晰，與生脈注射液樣品在相同位置上顯示相同顏色的斑點。符合《中國藥典》規(guī)定的要求。

2.2.3 五味子薄層鑒別 取本品50ml，水浴上濃縮至約25ml，移至分液漏斗中，加正己烷振搖提取3次，每次10ml濾過，合并濾液，蒸干，殘渣加三氯甲烷l ml使溶解，作為供試品溶液。另取五味子對照藥材2g，加水煎煮30min，濾過，濾液濃縮至約40ml，同法制成對照藥材溶液。再取五味子醇甲對照品，加三氯甲烷制成每1ml含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。按照2010年版《中國藥典》薄層色譜法試驗，分別吸取供試品溶液10μl、對照約材溶液和對照品溶液各1μl，分別點于同一硅膠板上，在溫度為20℃，濕度為65%的條件下，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（14∶5∶1）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，五味子對照藥材、五味子醇甲與生脈注射液樣品在相同位置上顯示相同顏色的斑點，Rf值適中，分離度良好。符合《中國藥典》規(guī)定的要求。

2.2.4 液相色譜鑒別 制備供試品溶液和對照提取物溶液（見含量測定項）。按照2010年版《中國藥典》高效液相色譜法試驗，色譜柱為Alltech Prevail Carbohydrate ES，乙腈-水（80∶20）為流動相，用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。結(jié)果供試品色譜中檢出與對照品（藥材）保留時間相同的四個主要色譜峰。

2.3 檢查項

2.3.1 pH值 參照2010年版《中國藥典》一部附錄VⅡ G進行pH值檢測，在溫度為20℃，濕度為65%的條件下，采用默克公司生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液為校準(zhǔn)試液，對該批樣品進行檢測，結(jié)果樣品的pH值為5.7，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3.2 溶液的顏色 參照2010年版《中國藥典》二部附錄XI A笫一法進行溶液顏色檢測，結(jié)果表明，樣品溶液淺于黃色9號標(biāo)準(zhǔn)比色液，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3.3 熾灼殘渣 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，參照2010年版《中國藥典》一部附錄IX J對樣品熾灼殘渣進行檢查，結(jié)果熾灼殘渣為0.5% （g/ml），符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3.4 總固體 精密量取本品10ml置已恒重的蒸發(fā)皿中，于水浴上蒸干后，在105℃干燥3 小時，移置干燥器中冷卻30min，精密稱定重量，測得樣品總固體為5.0% （g/ml），符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3.5 有關(guān)物質(zhì) 依據(jù)2010年版《中國藥典》一部附錄IX S的要求，分別對蛋白質(zhì)、樹脂、草酸鹽和鉀離子進行測定，結(jié)果均符合藥典規(guī)定要求。

2.3.6 熱原 依據(jù)2010年版《中國藥典》一部附錄XIII A，依法檢查，發(fā)現(xiàn)家兔升溫明顯。在排除外源性污染的可能性后再次重復(fù)熱原檢查，每次均取兩支樣品混勻作為供試液，結(jié)果兩次結(jié)果符合規(guī)定，一次結(jié)果邊緣，其原因可能是樣品之間的質(zhì)量不均一引起。按照2010年版《中國藥典》一部附錄“熱原檢查法”規(guī)定，熱原檢查無須復(fù)試即可直接判定為不合格。同時，中藥注射液屬于相對高危的注射劑，且該批樣品在臨床上已經(jīng)出現(xiàn)“發(fā)熱”情況，該品種也曾出現(xiàn)“發(fā)熱”等有關(guān)報道。因此認(rèn)為該批產(chǎn)品不符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

2.3.7 其他檢查 對該批樣品的異常毒性、過敏反應(yīng)、溶血與凝聚、無菌以及其他項（裝量、可見異物）按照2010年版《中國藥典》一部附錄進行檢查，均符合藥典規(guī)定要求。品的滲透壓摩爾濃度為288 mos mol/kg，不溶性微粒中10μm和25μm分別為298粒和7粒，均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。

2.4 色譜對比及含量測定

2.4.1 色譜條件 照高效液相色譜法（中國藥典2010年版一部附錄VI D）試驗，以Alltech PrevailTM Carbohydrate ES色譜柱為固定相，以乙腈-水為流動相，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為203nm。

2.4.2 供試品溶液的配置 取本品l ml，加50%乙腈稀釋至約10ml，混勻，作為供試品溶液。

2.4.3 對照品溶液的配置 取人參皂苷Rgl對照品、人參皂苷Re對照品和人參皂苷Rb1對照品及五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成毎1ml分別含0.10mg、0.08mg、0.20mg 和0.02mg的混合溶液，搖勻即得。

2.4.4 典型指紋圖譜 分別精密量取10 μl供試品溶液和對照品溶液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定。經(jīng)過比較所測定和紀(jì)錄的色譜圖，生成標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。見圖4。

由圖4可知，供試品指紋圖譜在8～95min范圍內(nèi)，共有17個特征色譜峰，且特征色譜峰基本能達到基線分離。按《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》以特征峰計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度為0.86。另外，對供試品色譜中峰面積高于Rb1峰面積5%的色譜峰進行積分，發(fā)現(xiàn)非特征峰面積之和為43%，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定低于50%的要求。

2.4.5含量測定 采用外標(biāo)單點校正法測定該批樣品中人參皂苷Rg1、Re和Rb1以及五味子醇甲的含量，平行測定三份，取平均值。該樣品中每1ml含紅參以人參皂苷Rg1、Re的總量計為0.20mg，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不少于0.1mg的要求；以人參皂苷Rb1計為0.23mg，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不少于0.1mg的要求；以人參皂苷Rg1、Re和Rb1的總量計為0.43mg，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（0.2～0.7mg）的要求。五味子以五味子醇甲計，該批樣品中每1ml含五味子為22.3μg，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不低于3.0μg的要求。

3 討論

3.1 整體質(zhì)量評 藥品的質(zhì)量穩(wěn)定、均一是保證有效性和安全性的前提。中藥注射劑，尤其是復(fù)方中藥注射劑與口服制劑相比，更應(yīng)開展嚴(yán)格的品質(zhì)評價研究，確保質(zhì)量穩(wěn)定，避免治療中因質(zhì)量不達標(biāo)而影響藥效或產(chǎn)生不良反應(yīng)。研究依據(jù)2010版《中國藥典》一部的要求，采用兔法對江蘇蘇中藥業(yè)所生產(chǎn)的生脈注射液進行檢測，在平行實驗中，一次兔子體溫明顯升高，其他三次體溫?zé)o明顯變化，與國家食品藥品監(jiān)督管理局公布的結(jié)果一致。初步認(rèn)為“發(fā)熱”是由該批樣品不均勻所致。此外，該批產(chǎn)品除熱原不合格外，其他均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定要求。

3.2 熱原不合格的原因分析 中藥注射液的“熱原”主要產(chǎn)于革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁，由脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)等組成的復(fù)合物。而脂多糖是一種微生物代謝產(chǎn)物，是內(nèi)毒素的主要成分，具有較強的熱原活性。熱原可以通過原料、溶劑、容器具帶入，制備過程中污染，滅菌不徹底或包裝不嚴(yán)也可產(chǎn)生熱原[9]。原料帶入的主要原因為原料質(zhì)量不佳，存放不當(dāng)，包裝不好，貯存時間太長，受污染等。另外，注射用水等溶劑制備不嚴(yán)格、蒸餾水器結(jié)構(gòu)不合理或注射用水貯存時間過長等，也有可能引入熱原[10]。

由于原料等不可避免的給中藥注射劑帶來熱原，隨之也開發(fā)了諸多控制熱源的技術(shù)[10]，如超濾膜分離法[11]、活性炭吸附法[12]、蒸餾法、離子交換法、酸堿處理法、高溫法以及反滲透等方法[13-14]除熱原的方法。中藥注射劑含有熱原量稍高就可引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，甚至危害生命，因此企業(yè)應(yīng)該越來越重視注射液中熱原的控制。

3.3 教訓(xùn)與建議

3.3.1 品質(zhì)評價 僅憑合格與不合格不能達到控制生脈注射劑安全，對于高危品種，特別是中藥注射劑的品質(zhì)評價應(yīng)包含批內(nèi)產(chǎn)品的均一性、同一廠家不同批次之間的均一性，這就對廠家提出了更高的生產(chǎn)要求。

3.3.2 對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和抽樣建議 通過對生脈注射液的全面分析，生脈注射液現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)是可行的，對產(chǎn)品質(zhì)量能起到一定的控制作用。但還應(yīng)該完善和提高現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，對高危中藥注射劑品種可以適當(dāng)增加檢查批次，減少或杜絕因批內(nèi)和批間差異引起的質(zhì)量問題。

3.3.3 加強監(jiān)管 要求企業(yè)完全要按GMP相關(guān)要求進行生產(chǎn)檢驗，強化生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)能力，通過行政監(jiān)管來促進生產(chǎn)企業(yè)檢驗技術(shù)的提高。

生脈注射液由紅參、麥冬、五味子組成，其功效由藥物相互作用、相互協(xié)調(diào)而共同體現(xiàn) ，而不良反應(yīng)的產(chǎn)生也是多方面因素的綜合表現(xiàn)。因生脈注射液由多種中藥成分組成，存在中藥類注射液常見的缺點，而臨床應(yīng)用廣泛且用量較大，如何在臨床安全應(yīng)用需要進行更深入的研究。

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（收稿日期：2015.06.30）