cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

王瑤函，吳蕊

（河南省阜外華中心血管病醫(yī)院 心肺功能科，河南 鄭州 450003）

高血壓以體循環(huán)動脈壓升高為特征，是伴有心臟、血管、腦和腎臟等器官功能性或器質(zhì)性損害的臨床綜合征[1]。高血壓治療不及時將導(dǎo)致腦溢血、動脈硬化、心肌梗死、腎衰竭和失明。高血壓的發(fā)病率和病死率逐年在增加，已嚴(yán)重威脅人類的生命與健康[2]。3'，5'-環(huán)化腺苷一磷酸（3'，5'-cyclic adenosine monophosphate, cAMP）在心肌收縮、血管平滑肌緊張性、細(xì)胞增殖和蛋白質(zhì)的合成等多種生物學(xué)活動中發(fā)揮作用[3]。本研究通過實驗觀察cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

WKY大鼠20只，體重200～215 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。20只大鼠隨機(jī)分為高血壓鼠和正常鼠，每組各10只。

1.2 試劑與儀器

蛋白提取試劑盒（美國Thermo Scientific公司），DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco公司），MTT試劑盒、DAB試劑盒、ROS試劑盒（廣州碧云天公司），腺苷酸環(huán)化酶激活劑（Forskolin，F(xiàn)SK）、一氧化氮合酶抑制劑（N-Nitro-L-arginine Methyl Ester，LNAME）、膠原酶Ⅰ、db-cAMP（美國Sigma公司）及其配套供給的稀釋溶劑，兔抗鼠Giα2抗體、兔抗鼠Giα3抗體、羊抗鼠表皮生長因子受體（EGFR）抗體、兔抗鼠p-EGFR抗體、兔抗鼠細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）抗體、兔抗鼠p-ERK1/2抗體、羊抗鼠原癌基因（c-Src）抗體、兔抗鼠pc-Src抗體和Dynein抗體（美國Abcam公司），ECL發(fā)光液（美國Millipore公司）。流式細(xì)胞儀（FACSVerse，美國BD公司），凝膠成像儀（GelDoc-It，美國UVP公司），酶標(biāo)儀（ELX800，美國Bio-Tek公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 一氧化氮（NO）缺乏性高血壓鼠模型的復(fù)制[4]正常鼠常規(guī)飼養(yǎng)，高血壓鼠每日喂食L-NAME，每天灌胃給藥L-NAME 1次，劑量為6 mg/kg，連續(xù)給藥1周和3周后，每天對大鼠進(jìn)行24 h動態(tài)血壓檢測和活動記錄，大鼠動態(tài)血壓的收縮壓/舒張壓符合白晝＞150/100 mmHg，夜間＞140/90 mmHg時為高血壓。

1.3.2 血管平滑肌的原代培養(yǎng) 正常和高血壓大鼠脫頸處死，75%酒精浸泡2～3 min，無菌臺中迅速將胸/腹主動脈取出，放到盛有預(yù)冷的PBS的平皿中清洗表面的凝血塊。把主動脈放到盛有DMEM+雙抗的培養(yǎng)皿中用手術(shù)鉗除去外膜和脂肪。將血管縱向剪開，用刀片自上而下輕輕刮2下，除去內(nèi)膜。放到加有3～5 ml 1 mg/ml膠原酶Ⅰ+DMEM+雙抗的15 ml管中，室溫孵育3 h。用20% FBS+雙抗的DMEM洗血管，把血管切成1 mm3的小片，內(nèi)膜一面朝下貼向培養(yǎng)瓶底，放到5% CO2培養(yǎng)中培養(yǎng)4 h貼壁后加入適量的20% FBS+雙抗的DMEM液。培養(yǎng)過夜。第2天換液，待組織處長出細(xì)胞后移去組織，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，待后續(xù)實驗用。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測活性氧（ROS） 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞胰酶消化計數(shù)后在24孔板中接種3×104/2 ml個細(xì)胞每孔，貼壁培養(yǎng)24 h。正常鼠血管平滑肌細(xì)胞加入0.5 mmol/L dbcAMP，高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP培養(yǎng)12 h，同時設(shè)空白對照組。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞2次。用無血清DMEM培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μl/L，每孔加入500 μl稀釋后的探針，培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清DMEM洗滌細(xì)胞3次，充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA探針。細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀定量檢測細(xì)胞ROS水平。

1.3.4 噻唑藍(lán)比色（MTT）法檢測db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞活性的影響 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞消化計數(shù)以每孔2×103個細(xì)胞（100 μl）的數(shù)量接種在96孔板培養(yǎng)24 h，分別加入0.5 mmol/L db-cAMP和FSK，同時設(shè)對照組，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。取出96孔板棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μl無血清的DMEM培養(yǎng)液，再每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl充分溶解，待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀在波長490 nm處讀取吸光度（A490）值。

1.3.5 Western blot檢測 取培養(yǎng)的正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞消化計數(shù)以每孔5×104個細(xì)胞的數(shù)量接種在6孔板培養(yǎng)24 h，正常鼠血管平滑肌細(xì)胞加入0.5 mmol/L db-cAMP，高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞加入0.1、0.3、0.5和1 mmol/L db-cAMP，同時設(shè)對照組，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測定每組蛋白濃度，每孔總蛋白上樣量為50 μg，上完樣后進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)PVDF膜（80 V，90 min），用封閉液（5%脫脂奶粉）封閉2 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用如下一抗Giα-2（1∶1000）、Giα-3（1∶1000）、p-EGFR（1∶5000）、p-EKR1/2（1∶2000）、ERK1/2（1∶1000）、c-Src（1∶1000）、pc-Src（1∶1000）和Dynein（1∶2000）4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1000的對應(yīng)二抗37℃搖床反應(yīng)1 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。然后采用ECL發(fā)光液顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進(jìn)行觀察，獲取圖像，并用Labworks 4.6軟件對圖像進(jìn)行灰度分析，記錄灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值。進(jìn)行3次獨(dú)立實驗后，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，均通過正態(tài)性檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

在正常鼠中（見圖1左），對照組細(xì)胞活性水平為（100.0±0.0）%，db-cAMP組和FSK組細(xì)胞活性水平均相近，3組整體比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.483，P=0.324），提示在正常鼠中db-cAMP和FSK對血管平滑肌細(xì)胞無促增殖作用。在高血壓鼠中（見圖1右），對照組細(xì)胞活性水平為（100.0±0.0）%，db-cAMP組細(xì)胞活性水平為（36.7±0.2）%，F(xiàn)SK組細(xì)胞活性水平為（49.1±0.3）%，3組整體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=24.483，P=0.025）；與對照組比較，db-cAMP組和FSK組細(xì)胞活性均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.916和4.136，P=0.021和0.039），提示db-cAMP和FSK對血管平滑肌細(xì)胞具有抑制增殖的作用。

圖1 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響

2.2 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞 Giα2 和 Giα3 蛋白表達(dá)的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中Giα2（見圖2A）和Giα3（見圖2B）的蛋白表達(dá)均增加（t=83.785和32.935，P=0.000和0.001）。①在高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0（mmol/L）db-cAMP后Giα2蛋白表達(dá)從開始的158.1逐漸下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP時還低，其中高血壓鼠的Giα2蛋白表達(dá)與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.171、14.008、6.880和31.502，P=0.002、0.005、0.020和 0.001），高血壓鼠中添加db-cAMP的Giα2蛋白表達(dá)均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.949、28.289、57.677和 83.653，P=0.001、0.000、0.000和 0.000）（ 見 圖2C和表1）；②在高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP 后 Giα3蛋白表達(dá)從開始的138.0逐漸下降，最終降到與正常鼠不添加db-cAMP時的水平相近，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP 的 Giα3 蛋白表達(dá)高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=32.935、13.313和 7.772，P=0.001、0.006和0.016），高血壓鼠中添加db-cAMP的Giα3蛋白表達(dá)均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.07、24.503、19.804和 22.093，均P=0.000）（見圖2D和表 2）。

圖2 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞Giα2和Giα3蛋白表達(dá)的影響

表1 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的Giα2/Dynein蛋白相對表達(dá)量比較 （n =10）

表2 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的Giα3/Dynein蛋白相對表達(dá)量比較 （n =10）

2.3 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中的超氧陰離子含量明顯增加（見圖3）。在高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的O2-含量從開始的42.12逐漸下降，甚至降到比正常鼠不添加db-cAMP時還低，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.3、1.0 mmol/L的O2-含量與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=14.440、3.348和 4.449，P=0.000、0.029和0.011），高血壓鼠中添加db-cAMP的O2-含量均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=12.433、16.210、13.633和17.183，均P=0.000）（見表3）。

2.4 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞EGFR蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP相比，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中EGFR的磷酸化水平表達(dá)增加（見圖4）。與正常鼠不添加db-cAMP相比，正常鼠添加0.5 mmol/L db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中EGFR的磷酸化水平變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分 別 加 入 0.1、0.3、0.5和 1.0 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平逐漸降低，從142.2降低到接近正常鼠不添加db-cAMP時的水平。其中高血壓鼠不添 加 db-cAMP、 添 加 0.1、0.3 mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=68.340、52.952和25.993，P=0.000、0.000和0.001），高血壓鼠中添加0.3、0.5和1.0mmol/L db-cAMP后EGFR的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.080、31.976和 40.912，均P=0.000）。見表 4。

圖3 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響

表3 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的O2-生成比較 （n =10）

2.5 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中ERK的磷酸化水平明顯增加（見圖5）。血管平滑肌細(xì)胞中ERK的磷酸化水平在高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，ERK的磷酸化水平均降低，從139.3直降至78.1，其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.5、1.0 mmol/L后ERK的磷酸化水平與正常鼠不添加db-cAMP比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=54.421、30.797、11.949和27.559，P=0.000、0.001、0.007和0.001），高血壓鼠中添加dbcAMP的ERK的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=22.695、26.886、45.280和56.967，均P=0.000）。見表 5。

圖4 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞EGFR蛋白磷酸化水平表達(dá)的影響

表4 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的pEGFR/總EGFR比較 （n =10）

圖5 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞ERK蛋白磷酸化水平表達(dá)的影響

表5 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的PERK1/2/總ERK1/2比較 （n =10）

2.6 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞c-Src蛋白磷酸化水平的影響

與正常鼠不添加db-cAMP比較，高血壓鼠不添加db-cAMP的血管平滑肌細(xì)胞中c-Src的磷酸化水平明顯增加（見圖6）。高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入0.1、0.3、0.5和 1.0mmol/L db-cAMP后c-Src的磷酸化水平降低，從177.3降至與正常鼠不添加db-cAMP時的水平接近。其中高血壓鼠不添加db-cAMP、添加0.1、0.3、0.5mmol/L db-cAMP 后c-Src的磷酸化水平高于正常鼠不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=56.544、93.928、36.290和22.761，P=0.000、0.000、0.000和0.001），高血壓鼠中添加dbcAMP的c-Src的磷酸化水平均低于不添加db-cAMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.411、17.528、23.924和50.542，P=0.012、0.000、0.000 和 0.000）。見表 6。

圖6 db-cAMP對正常鼠和高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞c-Src蛋白磷酸化水平的影響

表6 正常鼠和高血壓鼠不同db-cAMP濃度下的pc-Src/總c-Src比較 （n =10）

3 討論

cAMP是由腺苷酸環(huán)化酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)所產(chǎn)生的第2信使，在血管平滑肌緊張性和細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活動中發(fā)揮作用[3]。Gs和Gi分別是鳥嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)節(jié)因子和抑制因子，它們可以通過調(diào)節(jié)激素的水平從而調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性和cAMP的表達(dá)水平。Gi蛋白的表達(dá)減少可以誘導(dǎo)高血壓、心肌肥大和心力衰竭等多種病理狀態(tài)[5]。報道指出，在自發(fā)性高血壓鼠模型的心血管組織中，Gi蛋白表達(dá)、腺苷酸環(huán)化酶活性和cAMP的表達(dá)異常[6]。在自發(fā)高血壓鼠模型和醋酸脫氧皮質(zhì)酮高血壓鼠模型的心臟中，Gi蛋白表達(dá)增加導(dǎo)致cAMP水平的下降，并且自發(fā)高血壓鼠模型和醋酸脫氧皮質(zhì)酮高血壓鼠模型中，Giα蛋白表達(dá)的增加現(xiàn)象出現(xiàn)于高血壓現(xiàn)象出現(xiàn)之前，這表明Giα蛋白表達(dá)的增加和cAMP表達(dá)的下降可能是高血壓發(fā)病機(jī)制的重要因素[7]。通過用百日咳毒素處理2周大小的自發(fā)高血壓鼠模型來抑制Giα蛋白的活性，可以有效抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性并且增加cAMP的表達(dá)水平，同時緩解自發(fā)高血壓鼠模型高血壓狀態(tài)[8]。血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的Giα蛋白表達(dá)的增加可以被db-cAMP所抑制，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖[9]。本研究在探究cAMP對高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖影響的過程中發(fā)現(xiàn)與正常鼠模型中的血管平滑肌細(xì)胞相比，高血壓鼠模型中VSMC細(xì)胞中的Giα蛋白表達(dá)水平增加，并且細(xì)胞增殖速度加快。有報道指出[10-11]增加內(nèi)源性血管緊張素Ⅱ（ANG Ⅱ）和內(nèi)皮素1（ET-1）的表達(dá)可以增加Giα蛋白的表達(dá)和細(xì)胞增殖。

通過研究初步發(fā)現(xiàn)在高血壓鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞中，db-cAMP可以通過抑制ROS和ROS所介導(dǎo)的c-Src信號通路來抑制Giα蛋白表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖的提高。cAMP在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞增殖具有重要作用。其中cAMP已經(jīng)被證實可以調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、Swiss 3T3細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的增殖[12-13]。同時，cAMP也可以抑制多種細(xì)胞的增殖，例如白血病細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[14]。本研究選取db-cAMP，其為可以穿透細(xì)胞的cAMP類似物，作用于高血壓鼠模型中血管平滑肌細(xì)胞時，可以抑制Giα蛋白表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖。db-cAMP對正常鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖無抑制作用，而在高血壓鼠中，db-cAMP對血管平滑肌細(xì)胞具有抑制增殖的作用，加入db-cAMP后細(xì)胞活性分別大幅降低。高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入db-cAMP后Giα2和Giα3的蛋白表達(dá)亦明顯降低。

有報道顯示[15]在高血壓鼠模型的血管平滑肌細(xì)胞中，蛋白激酶A（PKA）抑制劑可以抑制db-cAMP對Giα蛋白表達(dá)增加和細(xì)胞增殖。因此筆者推測dbcAMP對抑制Giα蛋白表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖的潛在分子機(jī)制可能是由于PKA細(xì)胞通路介導(dǎo)的。本實驗發(fā)現(xiàn)，db-cAMP不僅可以抑制Gi蛋白表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖，同時還可以抑制ERK1/2的磷酸化，表明在高血壓鼠模型的VSMC細(xì)胞中，db-cAMP對于抑制Giα蛋白表達(dá)的增加和細(xì)胞增殖可能是由絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路介導(dǎo)的。EGFR活化可以提高Giα蛋白的表達(dá)和促進(jìn)細(xì)胞增殖[16]。本研究同時還發(fā)現(xiàn)，加入外源cAMP可以抑制EGFR的活性。初步說明，cAMP可能是通過抑制EGFR的表達(dá)從而抑制細(xì)胞的增殖和提高Gi蛋白的表達(dá)。

c-Src是介導(dǎo)氧應(yīng)激和EGFR反式激活的主要分子，c-Src抑制因子PP2可以抑制PDGFR和EGFR磷酸化水平的提高[17]。在高血壓鼠血管平滑肌細(xì)胞中分別加入0.1、0.3、0.5和1.0 mmol/L db-cAMP后，c-Src的磷酸化水平表達(dá)降低，0.5和1.0 mmol/L db-cAMP組分別降低。所以初步推測外源cAMP可以抑制高血壓鼠模型血管平滑肌細(xì)胞中c-Src磷酸化水平。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是，本研究的設(shè)計存在較大的不足和局限性：要觀察某一物質(zhì)是否具有某一新的作用，除了要設(shè)置陰性對照和陽性對照外（本實驗未設(shè)計），還應(yīng)做量-效實驗，至少要有5個濃度點，劑量范圍至少達(dá)100倍。而本研究觀察僅有4個點，劑量范圍也只有10倍（0、0.1、0.3、0.5和1.0），不是真正的量-效實驗，今后將按照此要求設(shè)計實驗，進(jìn)行量效關(guān)系的研究。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)cAMP可以抑制Giα蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖，氧化應(yīng)激，c-Src活化，EGF-R活化。提示db-cAMP抑制高血壓鼠模型的血管平滑肌細(xì)胞中Giα蛋白的表達(dá)提高和細(xì)胞增殖可能是由于其可以抑制氧化應(yīng)激的上升和下游的信號通路。即高血壓鼠中cAMP表達(dá)水平的增加可能具有保護(hù)高血壓細(xì)胞免受氧應(yīng)激所誘導(dǎo)的并發(fā)癥。