液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中β—受體激動(dòng)劑的殘留

姜曉野 張超

【摘 要】 本文論述了建立動(dòng)物源性食品中3種β-受體激動(dòng)劑（沙丁胺醇，克倫特羅，萊克多巴胺）殘留的檢測(cè)方法。結(jié)果表明：3種β-受體激動(dòng)劑在2ng/mL～100ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2均大于0.996，方法檢出限均小于0.1μg/kg，加標(biāo)回收率范圍在71.4%～91.6%。該方法相對(duì)易操作，重現(xiàn)性好。

【關(guān)鍵詞】 β-受體激動(dòng)劑 固相萃取 同位素 液相色譜-質(zhì)譜

【DOI編碼】 10.3969/j.issn.1674-4977.2015.11.007

β-受體激動(dòng)劑俗稱“瘦肉精”，是一類人工合成的藥物。β-受體激動(dòng)劑最常用的是克倫特羅和沙丁胺醇，因?yàn)閷⑵浼尤胄箢愶暳现?，?huì)減少脂肪的形成，明顯增加瘦肉率[1，2]，因此被長(zhǎng)期或屠宰前濫用。β-受體激動(dòng)劑一經(jīng)使用會(huì)大量在動(dòng)物的組織中殘留，尤其是肝臟、尿液、肉中含量最高。人食用了高殘留的β-受體激動(dòng)劑的肉類或肝臟后會(huì)引起呼吸、心率加快、胸悶、頭痛、肌肉震顫等中毒癥狀[3]。歐盟、美國(guó)和我國(guó)都先后立法禁止畜禽生產(chǎn)中食用該類藥物。日本允許將萊克多巴胺使用于動(dòng)物養(yǎng)殖，但是嚴(yán)格制定了最高殘留量[4]。

圖1 β-受體激動(dòng)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[5]、高效液相色譜法[6]、氣質(zhì)聯(lián)用法[7]、液質(zhì)聯(lián)用法[8]、放射免疫法[9]等。每種方法都有優(yōu)缺點(diǎn)，其中液質(zhì)聯(lián)用法具有定性準(zhǔn)確和測(cè)定效率高的特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。本方法參考了一些文獻(xiàn)中的液質(zhì)方法，采用了最佳的酶解條件和時(shí)間[10]，并改進(jìn)了一些前處理步驟，提高了工作效率，取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純，β-Glucuronidase/aryl sulfatase（>100，000units/mL），Waters MCX SPE固相萃取小柱（60mg-3CC，使用前依次用5%甲醇-氨，甲醇，水，0.1mmol/L高氯酸活化），乙酸銨、異丙醇、氫氧化鈉、氨水均為分析純，超純水，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均購(gòu)自Dr Ehrenstorfer：鹽酸克倫特羅（98.5%），鹽酸萊克多巴胺（97.0%），沙丁胺醇（99.5%），鹽酸克倫特羅-D9，萊克多巴胺-D6，沙丁胺醇-D3。

1.2 儀器與設(shè)備

固相萃取裝置（安捷倫），氮吹儀HSC-12B（天津恒奧），高速冷凍離心機(jī)CT15RT（上海天美），1290-6460 液相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫）。

1.3 儀器參數(shù)

（1）色譜條件

色譜柱：Agilent RRHD Eclipse plus C18，2.1mm×50mm，1.8μm，柱溫35℃，進(jìn)樣體積10μL，梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+），檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，毛細(xì)管電壓4000V，干燥氣流量10L/min，干燥氣溫度350℃，霧化器壓力35psi。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 待測(cè)物質(zhì)譜參數(shù)

注：*代表子離子用來(lái)做定量分析。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）取沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1μg/mL混標(biāo)。

（2）取沙丁胺醇-D3、萊克多巴胺-D6、克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)，用乙腈配制為10ng/mL混內(nèi)標(biāo)。

（3）將標(biāo)準(zhǔn)品配制成質(zhì)量濃度分別為5，10，25，40，80，160（ng/mL），內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為5ng/mL的系列工作溶液。

1.5 樣品處理

稱取5.00g樣品，于50mL離心管內(nèi)，加入濃度均為10ng/mL的三種內(nèi)標(biāo)工作液0.25mL，加入0.2moL/L乙酸銨溶液（pH5.2）10.0mL，再加入β-Glucuronidase/aryl sulfatase120μL（近似于2500u/g），渦旋混勻，37℃條件下，酶解6小時(shí)。酶解后10000r/min條件下離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入2mL高氯酸，再10000r/min條件下離心10min，上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，用12mol/L的NaOH溶液調(diào)pH至3-4，再5000r/min，-10℃條件下，離心5min，上清液過(guò)活化好的MCX-SPE 60mg-3CC小柱，依次用甲醇、5%甲醇水淋洗，用6mL5%甲醇氨洗脫，15mL離心管收集，氮吹吹干，加0.5mL水復(fù)溶，過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理，酶解，提取，凈化，色譜條件的選擇

在選擇每克加入2500u的β-Glucuronidase/aryl sulfatase，37℃條件下，酶解6小時(shí)。因β-Glucuronidase/aryl sulfatase在pH5.2的條件下活性最佳，因此選用pH5.2的乙酸銨溶液來(lái)提取，凈化選了MCX固相萃取小柱，對(duì)弱堿性的β-受體激動(dòng)劑有很強(qiáng)的吸附作用，凈化效果好。乙腈-酸性水流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)目標(biāo)物有增強(qiáng)離子化效率的作用，采用安捷倫的質(zhì)譜設(shè)備對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了摸索。最后得到了目標(biāo)物多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)質(zhì)譜圖，如圖2所示。

質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，待測(cè)物的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，在合適的條件下所有的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)都取得了良好的響應(yīng)值。

2.2 方法檢出限，標(biāo)曲線性及回收率

按照1.4中標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法配制不同濃度的標(biāo)液，按照1.3中的儀器參數(shù)進(jìn)行分析，質(zhì)譜峰的響應(yīng)高度為縱坐標(biāo)，待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制沙丁胺醇、萊克多巴胺、克倫特羅的曲線，如圖3所示。

圖3 三種β-受體激動(dòng)劑的曲線線性

從圖3可見(jiàn)，3種β-受體激動(dòng)劑在5ng/mL～150ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，各組分的相關(guān)系數(shù)R2>0.996。以各目標(biāo)物在空白樣品中的S/N=3計(jì)算方法檢出限，三種β-受體激動(dòng)劑的檢出限均小于0.1μg/kg，滿足檢測(cè)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)要求。

2.3 方法回收率

在空白樣品中分別加入濃度為10ng/mL、20ng/mL混合標(biāo)液，混勻后按1.5的方法進(jìn)行處理，按1.3中的儀器參數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分析，二個(gè)添加水平的回收率見(jiàn)表3。

表3 三種β-受體激動(dòng)劑的回收率

由上表可看出，三種β-受體激動(dòng)劑的回收率在71.4～91.6之間，總體較理想。

3 結(jié)論

該方法的前處理利用酶解法，提高了樣品提取效率，用固相萃取去除干擾物質(zhì)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行了有效的提取，摸索出了合理的液相和質(zhì)譜條件，處理步驟簡(jiǎn)單易操作，重現(xiàn)性好，方法回收率較高，靈敏度滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)要求，適用于食品中β-受體激動(dòng)劑的檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]丁煥中，陳杖榴，楊志凌.營(yíng)養(yǎng)重分配劑萊克多巴胺的藥理作用和應(yīng)用[J].獸藥與飼料添加劑，2002，（1）：18-20.

[2]Smith D J. The pharmacokinetics， metabolis， and tissue residues of β-adrenergic agonists in livestock[J].J Anim Sci，1998，76（1）：173-194.

[3]王竹天，楊大進(jìn).食品安全與健康[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：103.

[4]Sakai T， Hitomi T， Sugaya K， et al. Determination method for ractopamine in swine and cattle tissues using LC/MS[J]. Food Hyg Soc Japan，2007，48（5）：144-147.

[5]Howells L， Sauer M， Sayer R D Clark， Extraction and clean-up of theβ-agonists salbutamol from liver and its determination by enzyme immuoassay[J].Analytica Chimica Acta， 1993：275-278.

[6]林奕芝，劉奮，戴京晶，梁偉.高效液相色譜法測(cè)定肉與肉制品中鹽酸克倫特羅殘留量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，（2）：180-181.

[7]吳銀良，李曉薇，劉素英，沈建忠，楊挺.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肝臟組織中鹽酸克倫特羅和鹽酸菜克多巴胺.分析化學(xué)【J】，2006，（8）：1083-1086.

[8]農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-18-2008.動(dòng)物源性食品中β-受體激動(dòng)劑殘留檢測(cè) 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].

[9]COLLINS S， O KEEFE M， SMYTH M R， Multi-residue anlysis for β-agonists in urine and liver samples using mixedphase columns with determination by radio immunoassay. Analyst，1994，119：2671-2674.

[10]曾紹東，王明月，楊春亮，查玉兵，林玲.超高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定豬肉中9種β-受體激動(dòng)劑殘留量[J].分析儀器，2013年（4）：5-11.

作者簡(jiǎn)介

姜曉野，工程師，大連工業(yè)大學(xué)碩士研究生畢業(yè)，現(xiàn)就職于撫順市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所食品檢測(cè)中心，從事食品檢測(cè)工作。

張超，高級(jí)工程師，機(jī)械設(shè)計(jì)及制造專業(yè)，學(xué)士學(xué)位，從事實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理和質(zhì)量控制方面的工作。

（責(zé)任編輯：張曉明）