不同體外培養(yǎng)方法對(duì)去透明帶小鼠胚胎發(fā)育的影響

王雅光　高源　秦書(shū)儉

[摘要] 目的 探討不同體外培養(yǎng)方法對(duì)小鼠去透明帶胚胎發(fā)育的影響。 方法 以胚胎各階段發(fā)育率、囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)作為衡量指標(biāo)，對(duì)比微滴單卵法、微滴群卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW培養(yǎng)法（the modified “well of well” system）四種體外培養(yǎng)方法，探討不同體外培養(yǎng)方法對(duì)去透明帶胚胎發(fā)育的影響。 結(jié)果 mWOW培養(yǎng)法、微滴單卵+群卵法、微滴單卵法這三種方法之間的發(fā)育率、囊胚率以及囊胚數(shù)均有顯著差異（P<0.05）。 結(jié)論mWOW法與其他三種方法相比，更適合作為體外培養(yǎng)去透明帶小鼠8-細(xì)胞以后階段的方法，以及用于體內(nèi)移植小鼠胚胎的體外培養(yǎng)方法。

[關(guān)鍵詞] 胚胎培養(yǎng)技術(shù)； 胚胎發(fā)育； mWOW法

[中圖分類號(hào)] Q954.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）16-0018-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of different culture methods in vitro mouse zona-free embryonic development. Methods In various stages of embryonic development rate，blastocyst rate and cell numbers of blastocysts developed were measured as mWOW system （the modified “well of well” system）， micro-drops single + group， micro-drops single and micro-drops group culture in vitro. The effects of different methods of were compared in vitro embryo development zona-free. Results Embryonic development rate， blastocyst rate and cell numbers of blastocysts developed were significantly higher in mWOW system culture than micro-drops single + group， micro-drops single and micro-drops group culture. Conclusion Compared with micro-drops single + group，micro-drops single and micro-drops group culture，mWOW system method is more suitable for zona-free cultured in vitro mouse embryos.

[Key words] Embryo culture techniques； Embryonic development；mWOW method

現(xiàn)階段，體外培養(yǎng)去透明帶小鼠胚胎已經(jīng)成為研究早期胚胎發(fā)育機(jī)制、制備轉(zhuǎn)基因小鼠等科學(xué)研究領(lǐng)域中的重要環(huán)節(jié)。但是由于去透明帶后的胚胎容易因?yàn)轲じ骄奂膯?wèn)題發(fā)育延遲或者停止，影響囊胚率和囊胚質(zhì)量。因此，有學(xué)者[1]提出如要推動(dòng)慢病毒感染去透明帶胚胎技術(shù)的發(fā)展，需要考慮的是如何完善去透明帶胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)。

目前，去透明帶胚胎體外培養(yǎng)方法主要有微滴單卵法、微滴群卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW培養(yǎng)法。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)這四種方法對(duì)比來(lái)培養(yǎng)去透明帶胚胎并觀察其發(fā)育情況，通過(guò)對(duì)每個(gè)階段囊胚細(xì)胞個(gè)數(shù)、囊胚率以及發(fā)育率的檢測(cè)，來(lái)討論四種體外培養(yǎng)方法對(duì)去透明帶胚胎發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

本實(shí)驗(yàn)于2011年3月～2012年3月完成。由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的4～6周齡的SPF級(jí)昆明小鼠，PMSG購(gòu)自鄭州華畜動(dòng)物制藥廠，F(xiàn)HM操作液、KSOM培養(yǎng)液購(gòu)自Jibco公司，人絨毛促性腺激素、石蠟油、透明質(zhì)酸酶、鏈酶蛋白酶、PVP均購(gòu)自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 超數(shù)排卵 取已適應(yīng)本鼠舍光照周期（內(nèi)源LH釋放時(shí)間受光照周期的調(diào)控）的昆明小鼠，進(jìn)行超數(shù)排卵的時(shí)間為下午1時(shí)，注射PMSG，過(guò)48 h后注射hCG（注射方法均經(jīng)腹腔，劑量均為10 IU/只），然后將雌雄（2∶1）合籠，次日上午通過(guò)檢查陰道栓方式確定受精母鼠。

1.2.2 去除卵丘細(xì)胞及透明帶 經(jīng)陰道栓檢查確定受精的母鼠頸椎脫臼處死，在無(wú)菌條件下快速取出輸卵管及靠近輸卵管部分的子宮，放置在FHM操作液里。鏡下取出合子團(tuán)，然后將其放入含有透明質(zhì)酸酶（濃度為0.3 mg/mL）的FHM操作液里，將卵丘細(xì)胞吹打脫落以后，再將重新收集的合子放入準(zhǔn)備好的FHM操作液里，繼續(xù)洗去雜質(zhì)、透明質(zhì)酸酶以及殘留的卵丘細(xì)胞等。最后在鏈酶蛋白酶液（濃度為0.5%）中放入洗滌好的合子，同時(shí)鏡下觀察透明帶，待其溶解后，再迅速放入新鮮的FHM操作液中清洗，之后再經(jīng)KSOM培養(yǎng)液洗滌。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及培養(yǎng) 將收集的去透明帶合子，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為四組，A：微滴單卵培養(yǎng)組；B：微滴群卵培養(yǎng)組；C：微滴單卵+群卵培養(yǎng)組；D：mWOW培養(yǎng)組。

微滴單卵培養(yǎng)組：將用KSOM-AA培養(yǎng)液做的20個(gè)2 μL的微滴滴在35 mm的培養(yǎng)皿（塑料無(wú)菌）上，待2 h后將每個(gè)微滴里放入1枚合子，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

微滴群卵培養(yǎng)組：將用KSOM-AA培養(yǎng)液做的1個(gè)3 μL的微滴滴在35 mm的培養(yǎng)皿（塑料無(wú)菌）上，所有微滴用石蠟油覆蓋，待2 h后每個(gè)微滴里放入20～25枚合子，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

微滴單卵+群卵培養(yǎng)組：觀察待微滴單卵培養(yǎng)方法體外培養(yǎng)出來(lái)的胚胎基本已經(jīng)完全發(fā)育到8-細(xì)胞階段，此時(shí)開(kāi)始進(jìn)行群體的培養(yǎng)，移動(dòng)時(shí)使用移卵管，以減少胚胎的損傷。

mWOW培養(yǎng)組：按照Pereira等[2]制作mWOW孔的方法，將針頭加熱后在35 mm無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿上20個(gè)孔（孔深0.2 mm、直徑0.3 mm左右），之后打完孔的培養(yǎng)皿用KSOM和DDW培養(yǎng)液洗滌使孔中的雜質(zhì)清除。所有的mWOW孔先用400 μL KSOM培養(yǎng)液滴覆蓋，然后KSOM培養(yǎng)液滴上再覆蓋一層薄薄的石蠟油。待2 h后將每個(gè)mWOW孔里放置一枚合子，放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)培養(yǎng)6次，隨機(jī)將484枚合子（去透明帶）分成四組；即微滴單卵組合子數(shù)為120枚、微滴群卵組合子數(shù)為124枚、微滴單卵+群卵組合子數(shù)為120枚、mWOW組合子數(shù)為120枚，四個(gè)組用相同的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)液培養(yǎng)。2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚以及囊胚發(fā)育情況的檢測(cè)時(shí)間，分別是在培養(yǎng)到20 h、40 h、52 h、64 h、88 h。取出的囊胚經(jīng)過(guò)染色計(jì)算囊胚細(xì)胞數(shù)。見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用析因方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同體外培養(yǎng)方法培養(yǎng)去透明帶合子后的發(fā)育情況

由于去透明帶后的合子黏性增加粘連而使微滴群卵法只能在2-細(xì)胞階段統(tǒng)計(jì)發(fā)育情況，其他各階段都無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；其他三種方法均能進(jìn)行發(fā)育率的計(jì)算。在2-細(xì)胞發(fā)育階段四種方法之間發(fā)育率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在4-細(xì)胞發(fā)育階段微滴單卵法、微滴單卵+群卵法、mWOW法之間的發(fā)育率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在8-細(xì)胞發(fā)育階段微滴單卵法與微滴單卵+群卵法發(fā)育率相比較沒(méi)有明顯的差異（P>0.05），而兩組均高于mWOW培養(yǎng)法的發(fā)育率，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在桑葚胚發(fā)育階段mWOW法和微滴單卵+群卵法的發(fā)育率比較沒(méi)有明顯差異（P>0.05），但是兩組的培養(yǎng)率均高于微滴單卵培養(yǎng)法的發(fā)育率，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

2.2不同培養(yǎng)方法得到的囊胚回收率及囊胚計(jì)數(shù)情況

從囊胚回收率的結(jié)構(gòu)上看微滴單卵法和微滴單卵+群卵法囊胚均是100%的回收率，與mWOW法的囊胚回收率相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；微滴單卵法、微滴單卵+群卵法和mWOW法三種方法得到的囊胚細(xì)胞數(shù)與體內(nèi)囊胚的細(xì)胞數(shù)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。群卵法和微滴單卵法與單純的微滴單卵培養(yǎng)方法相比較得到的囊胚的細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯的差異（P>0.05），但是這兩種培養(yǎng)方法培養(yǎng)的囊胚細(xì)胞數(shù)與mWOW培養(yǎng)方法相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

微滴培養(yǎng)法是傳統(tǒng)小鼠胚胎體外培養(yǎng)方法[3]，也是培養(yǎng)去透明帶胚胎的常用方法。經(jīng)過(guò)多年發(fā)展，人們通過(guò)對(duì)微滴法進(jìn)行改進(jìn)，發(fā)明了微滴群卵法等諸多培養(yǎng)方式，以期進(jìn)一步優(yōu)化胚胎體外培養(yǎng)系統(tǒng)。但是，各種[4]改進(jìn)方法雖然能夠發(fā)揮群體培養(yǎng)優(yōu)勢(shì)，通過(guò)縮小胚胎間距來(lái)促進(jìn)胚胎發(fā)育[5]，但是去透明帶胚胎相互黏連、聚合，導(dǎo)致無(wú)法繼續(xù)發(fā)育的問(wèn)題無(wú)法解決。2000年Vajta等[6]發(fā)現(xiàn)WOW體外培養(yǎng)去透明帶的方法不但培養(yǎng)效率高，而且操作方法比較簡(jiǎn)單。近年來(lái)，也有人相繼報(bào)道應(yīng)用這一方法成功培養(yǎng)了單個(gè)胚胎，并且胚胎發(fā)育率及移植后妊娠率均顯著高于微滴法[7]，后來(lái)又有研究發(fā)現(xiàn)[8]單個(gè)胚胎的培養(yǎng)效果并不如群體的培養(yǎng)。2005年Daniela等[9]將WOW培養(yǎng)法進(jìn)行了改進(jìn)，因而有了mWOW培養(yǎng)方法，該方法是用一個(gè)400 μL的微滴覆蓋大約40左右個(gè)V形孔，改善了原來(lái)的一個(gè)微滴覆蓋一個(gè)V形孔的方法。這種方法不但解決了透明帶黏連問(wèn)題還增強(qiáng)了胚胎之間的自分泌/旁分泌因子對(duì)胚胎發(fā)育的促進(jìn)作用[10]，并且這種培養(yǎng)去透明帶胚胎的方法優(yōu)于WOW法也得到了證實(shí)[11]。

四種方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析：mWOW法除8-細(xì)胞階段發(fā)育率、囊胚回收率低于微滴單卵+群卵法和微滴單卵法，其他各階段mWOW法均顯著高于其他兩種方法，由于微滴群卵培養(yǎng)法因透明帶合子粘連無(wú)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)將其除外。由于體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境不同，由于桑椹胚在體外經(jīng)過(guò)短時(shí)間的發(fā)育就能形成胚囊，所以要求體外培養(yǎng)時(shí)間相對(duì)而言越短越好。所以選擇進(jìn)行體外培養(yǎng)桑葚胚減少胚胎發(fā)育的損失進(jìn)而會(huì)提高胚囊率。與8-細(xì)胞早期的胚胎比較致密化的桑椹胚的結(jié)構(gòu)空間更穩(wěn)定、胚胎更強(qiáng)韌，從而能盡可能地減少mWOW法對(duì)8-細(xì)胞期胚胎發(fā)育的不良影響。mWOW法的V形孔不但可以抑制有害因子的釋放，而且還能夠在一定程度上避免細(xì)胞因子的擴(kuò)散[12]。綜上，mWOW法更適合作為體外培養(yǎng)去透明帶小鼠胚胎的方法。

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（收稿日期：2015-03-25）