莪術(shù)醇β—環(huán)糊精包合物對(duì)Bel—7404肝癌細(xì)胞體外抑瘤作用和細(xì)胞周期影響的研究

龔玲等

[摘要] 目的 探討莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物作用對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖與凋亡及細(xì)胞周期的影響及其分子機(jī)制。 方法 采用不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理肝癌Bel-7404細(xì)胞后，噻唑藍(lán)[3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di-phenytetrazoliumromide， MTT]比色法測(cè)定細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡情況。Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)水平。 結(jié)果 MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物各劑量組生長(zhǎng)抑制率均明顯升高，呈劑量與時(shí)間依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理促進(jìn)細(xì)胞凋亡（P<0.05），并使細(xì)胞阻滯在G0/G1期（P<0.05），伴隨p21WAF1及p27KIP1的表達(dá)水平升高。 結(jié)論 莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物能夠抑制肝癌細(xì)胞Bel-7404的增殖，促進(jìn)凋亡，并通過(guò)上調(diào)p21WAF1及p27KIP1基因的表達(dá)而誘導(dǎo)G1期阻滯。

[關(guān)鍵詞] 肝癌；莪術(shù)醇；β-環(huán)糊精；細(xì)胞周期阻滯

[中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）16-0011-04

[Abstract] Objective To investigate the effects and mechanisms of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on the proliferation， apoptosis， and cell cycle of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404. Methods The effects of different dose of curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound on proliferation of human hepatocarcinoma cell line Bel-7404 in vitro was analyzed by MTT assay（P<0.05）. The cell cycles and apoptosis were detected by flow cytometer（P<0.05）. Expression of cycle regulation-related genes were assessed by Western blot. Results Compared with control groups， MTT results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound significantly inhibited the proliferation of Bel-7404 cells in a dose- and time-dependent manner. The results of flow cytometry showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound resulted in the cell cycle arrest at G0/G1 phase and increased the apoptotic cell fraction（P<0.05）. Western blotting results showed that curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound increased the expression of p21WAF1 and p27KIP1. Conclusion Curcumol-β-cyclodextrin inclusion compound inhibits the growth and induces apoptosis and G0/G1 phase arrest of Bel-7404 in vitro. The mechanisms of G1 arrest may be related to the regulation of the p21WAF1 and p27KIP1.

[Key words] Hepatocarcinoma； Curcumol； β-cyclodextrin； Cell cycle arrest

原發(fā)性肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，一旦確診多數(shù)患者已為晚期，喪失手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)[1]。盡管肝癌的綜合治療措施不斷發(fā)展完善，但目前肝癌患者的預(yù)后極差。因此，開(kāi)發(fā)治療效果好、毒副作用小的抗腫瘤治療藥物，從而進(jìn)一步提高肝癌的治療效果，是臨床和基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)。已有的大量研究表明，中醫(yī)藥在腫瘤治療方面有著獨(dú)特、高效、低毒的優(yōu)勢(shì)[2]。莪術(shù)醇，又名姜黃環(huán)奧醇，是從傳統(tǒng)中藥莪術(shù)揮發(fā)油中提取出來(lái)的倍半萜類(lèi)化合物。已有研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇能夠以劑量依賴的方式抑制肝癌、卵巢癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，表明莪術(shù)醇具有開(kāi)發(fā)應(yīng)用的前景[3]。但莪術(shù)醇水溶性不佳，限制了其在臨床與基礎(chǔ)研究里的應(yīng)用價(jià)值。如何提高其水溶性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。β-環(huán)糊精是一種常用的藥物輔料，具有良好的水溶性和增溶效果，其安全性已被廣泛認(rèn)可[4]。β-環(huán)糊精的作用機(jī)制是通過(guò)將水溶性差的分子包入其疏水性空腔中，進(jìn)而形成水溶性包合物，以提高藥物的溶解性能，增加藥物的生物利用度。我們之前的研究中制備的莪術(shù)醇與β-環(huán)糊精的包合物，較莪術(shù)醇的溶解度提高了10.3倍。有關(guān)體外抗腫瘤活性研究發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物可明顯抑制食管癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡[5]。本研究在此基礎(chǔ)上，于2014年6～12月進(jìn)一步觀察莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物對(duì)人肝癌Bel-7404細(xì)胞的抑制效果，并探討其對(duì)細(xì)胞周期及其細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑來(lái)源

莪術(shù)醇（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；MTT（美國(guó)Invitrogen公司）；β-環(huán)糊精（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；兔抗人p21單克隆抗體（美國(guó)CST公司）；兔抗人p27單克隆抗體（美國(guó)CST公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；Annexin V-FITC-PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Bel-7404人肝癌細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 MTT法測(cè)定肝癌細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為25、50、100 mg/L莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)48 h與72 h后，每孔分別加入MTT溶液50 μL（5 g/L），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后結(jié)束培養(yǎng)。然后，每孔加入150 μL DMSO，放于搖床振蕩10 min，在酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定每孔的吸光值（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值，并計(jì)算相應(yīng)的生長(zhǎng)抑制率。公式：生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-藥物組A值/對(duì)照組A值）×100%。

1.3.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，經(jīng)莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h 后，胰酶消化，收集各組細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，分別加入1×Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，然后各加入5 μL PI與5 μL Annexin V-FITC充分混勻后，室溫、靜置15 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。

1.3.3 細(xì)胞周期檢測(cè) Bel-7404細(xì)胞經(jīng)25、50、100 mg/L莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h后，分別收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，于4℃、70%乙醇固定24 h。PBS洗3次后，加入Tris-HCl緩沖液，37℃避光孵育30 min，加入50 μg/mL的PI進(jìn)行細(xì)胞DNA染色。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，分別計(jì)算處于各期的細(xì)胞所占比例。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá) Bel-7404細(xì)胞經(jīng)不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。取煮沸后的蛋白樣品50 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。室溫封閉2 h，分別加入兔抗人p21與p27單克隆抗體（1∶1000）4℃過(guò)夜。充分洗滌后，加入1∶3000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育2 h。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色檢測(cè)特異條帶，并以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（x±s）表示。多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，樣本間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

經(jīng)不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理Bel-7404細(xì)胞48 h與72 h后，細(xì)胞增殖能力下降，見(jiàn)圖1。25、50、100 mg/L濃度的莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h后，Bel-7404細(xì)胞的抑制率分別為（14.41±1.32）%，（27.38±1.05）%與（34.75±1.49）%，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖明顯受到抑制，有明顯的劑量依賴性（F=38.75，P<0.05）。各濃度作用72 h后，Bel-7404細(xì)胞的抑制率分別為（18.99±1.62）%，（34.89±2.38）%與（44.24±1.83）%，有明顯的劑量依賴性（F=64.99，P<0.01），提示莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物能夠以時(shí)間與劑量依賴的方式抑制肝癌細(xì)胞Bel-7404的增殖。

2.2 莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

通過(guò)不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h后，25、50、100 mg/L濃度組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見(jiàn)凋亡率分別為（4.29±0.77）%，（9.41±1.56）%，（16.38±1.05）%，（23.75±1.98）%，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物作用后肝癌細(xì)胞的凋亡率明顯增加，并且隨莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物的劑量增加而增加（F=74.37，P<0.01）。提示莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物能夠以劑量依賴的方式誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

2.3 莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理對(duì)細(xì)胞周期的影響

采用不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理48 h后，Bel-7404細(xì)胞周期分布出現(xiàn)明顯變化，見(jiàn)表1。不同濃度莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理后可引起G2/M期（F=18.68，P<0.05）與S期的細(xì)胞比例逐漸減少（F=18.12，P<0.05），而G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加（F=88.01，P<0.01）。提示莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物可導(dǎo)致Bel-7404細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期細(xì)胞阻滯，且在（25～100）mg/L濃度范圍內(nèi)隨著莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物濃度增加，其阻滯作用增強(qiáng)。

2.4 莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物處理對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)的影響

采用Western blot檢測(cè)莪術(shù)醇處理48 h后Bel-7404細(xì)胞中p21WAF1與p27KIP1蛋白水平。結(jié)果顯示，經(jīng)莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合處理，細(xì)胞的p21WAF1與p27KIP1蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，見(jiàn)圖2。提示細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子p21WAF1與p27KIP1參與了莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物所誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯。

3 討論

莪術(shù)醇是從中藥莪術(shù)中分離得到的單體化合物，具有高效低毒的特點(diǎn)，作為傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物，近年來(lái)被試用于治療腫瘤并取得一定成效[6，7]。但由于其水溶性極低，限制了開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。為增加莪術(shù)醇的水溶性，研究人員進(jìn)行了多種嘗試。β-環(huán)糊精是一種安全有效的藥物增溶劑，能夠增加藥物的溶解度和利用度。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物水溶性增加，并具有體外抗食管癌作用。

在此基礎(chǔ)上，我們研究了莪術(shù)醇β-環(huán)糊精合成的包合物的體外抗肝癌細(xì)胞活性。研究結(jié)果表明，包合物可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步的細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包和物有誘導(dǎo)明顯的G0/G1期阻滯，提示莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包和物抗肝癌機(jī)制，可能與誘導(dǎo)凋亡與細(xì)胞周期阻滯有關(guān)。

增殖與凋亡的異常是惡性腫瘤的顯著特征，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡是目前腫瘤藥物研發(fā)的關(guān)鍵，也是評(píng)估抗腫瘤藥物效果的重要指標(biāo)[8，9]。大量的體外研究已證實(shí)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是莪術(shù)醇發(fā)揮抗腫瘤作用的重要機(jī)制[10，11]。莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包和物可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，提示其可能成為抗肝癌治療的候選藥物。

細(xì)胞周期正常運(yùn)行受到細(xì)胞周期蛋白（cyclin）、周期蛋白依賴性激酶（CDK）和CDK抑制物（CDKI）等多種調(diào)控因子的調(diào)節(jié)。真核細(xì)胞內(nèi)主要存在3個(gè)檢查點(diǎn)（check point）：G1/S 期、G2/M期及紡錘體裝配檢查點(diǎn)，檢查點(diǎn)的異常導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，細(xì)胞增殖失控，發(fā)生癌變[12，13]。CDK是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的效應(yīng)器，推動(dòng)細(xì)胞通過(guò)檢查點(diǎn)。CDK的活性受到cyclin的調(diào)控[14，15]。CDK在細(xì)胞周期特定的時(shí)間與特異的cyclin結(jié)合，形成cyclin-CDK復(fù)合物，并磷酸化細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)底物，從而推動(dòng)細(xì)胞周期向下一階段的運(yùn)行。p21WAF1和p27KIP1均為CDKI家族在G1期的重要負(fù)調(diào)控因子，對(duì)多種G1和S期的cyclin-CDK復(fù)合物均有抑制作用，使細(xì)胞周期阻滯于G1期[16]。本研究采用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包和物能夠顯著升高p21WAF1和p27KIP1的表達(dá)，從而引起G1期阻滯。

綜上所述，莪術(shù)醇β-環(huán)糊精包合物能夠抑制肝癌細(xì)胞Bel-7404的增殖，其機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，通過(guò)上調(diào)p21WAF1及p27KIP1的表達(dá)，引起 G1期阻滯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2015-02-02）