δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠肝線粒體呼吸功能的保護(hù)作用

唐成武等

[摘要] 目的 探討δ阿片受體激動劑DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin）對膿毒癥大鼠肝線粒體呼吸功能的保護(hù)作用。 方法 將60只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為膿毒癥組（SEP組，n=20）、假手術(shù)組（SO組，n=20）和DADLE組（n=20）。采用改良盲腸結(jié)扎穿孔方法建立膿毒癥大鼠模型，假手術(shù)組除不結(jié)扎刺穿盲腸，DADLE組建立模型后按5 mL/kg劑量腹腔注射濃度為0.5 mg/mL的DALDE。制模8 h后處死大鼠， 取血清檢測ALT和AST水平，取肝組織測定肝細(xì)胞線粒體呼吸功能及肝組織ATP、ADP、AMP含量。 結(jié)果 DADLE組大鼠呼吸控制率（RCR）、磷/氧化（ADP/O）與SEP組比較顯著升高（P<0.05）， DADLE組肝臟ATP含量明顯高于SEP組（P<0.05）。DADLE組與SEP 組比較血ALT和AST水平明顯降低（P<0.05）。 結(jié)論 DADLE對膿毒癥大鼠肝臟線粒體呼吸功能具有保護(hù)作用，可改善肝細(xì)胞能量代謝。

[關(guān)鍵詞] δ阿片受體激動劑；膿毒癥；盲腸結(jié)扎穿孔；線粒體

[中圖分類號] R96 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）16-0008-03

[Abstract] Objective To study the protective effect of δ opioid receptor agonist DADLE（D-Ala2-D-Leu5-enkephalin） on mitochondrial respiratory function in a rat model of sepsis. Methods Sixty SD rats were randomly divided in to sham operated group （SO）， septic group （SEP）， and DADLE group （DADLE）， each of 20 cases. Sepsis model was produced by cecal ligation and puncture （CLP）. In SO group，the abdomen was opened without any other treatment. In DADLE group， DADLE （0.5 mg/mL） was administer at a dose of 5 mL/kg by intra-peritoneal injection after CLP. All rats were sacrificed 8 hours after CLP. ALT and AST in blood were determined. Mitochondrial respiratory function was evaluated by the clark oxygen eletrode. The levels of ATP， ADP， AMP were determined by high performance liquid chromatography （HPLC）. Results RCR and ADP/O in DADLE group were much higher than that in SEP group （P<0.05）. ATP in DADLE groups were much higher than SEP group （P<0.05）， while ALT and AST of DADLE group were significantly lower than SEP group （P<0.05）. Conclusion DADLE can protect mitochondrial respiratory function and improve the hepatocellular energy metabolism in sepsis.

[Key words] DADLE； Sepsis； CLP； Mitochondria

在膿毒癥（sepsis）發(fā)展過程中肝臟是易受累的重要器官，因?yàn)槟摱景Y早期便可出現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的破壞，而線粒體在肝細(xì)胞物質(zhì)代謝、信息轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等方面起著至關(guān)重要的作用，因此肝臟線粒體的損傷常常導(dǎo)致肝細(xì)胞能量代謝障礙及內(nèi)環(huán)境紊亂， 最終介導(dǎo)肝細(xì)胞死亡[1-3]。膿毒癥早期肝細(xì)胞大量壞死，肝功能損害發(fā)展為肝功能衰竭往往是膿毒癥引起多器官功能衰竭（MODS）的開始和重要標(biāo)志[4，5]。2013年6～10月我們以非選擇性阿片受體激動劑DADLE處理膿毒癥大鼠，并觀察其對肝細(xì)胞線粒體呼吸功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1分組及膿毒大鼠癥模型制備

健康清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7～8周齡，體重：270～320 g） 60只由斯萊克（SLAC，上海）實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供，隨機(jī)分為膿毒癥組（SEP組，n=20）、假手術(shù)組（SO組，n=20）和DADLE組（n=20）。

膿毒癥大鼠模型制備：剖腹后找到盲腸，結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端，對傳統(tǒng)的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP） 方法進(jìn)行改良：結(jié)扎盲腸遠(yuǎn)端后用12號針頭穿刺近端盲腸造成穿孔，將盲腸穿孔數(shù)由2個增至4個[6]，而SO組僅行剖腹但不結(jié)扎刺穿盲腸，其余操作同膿毒癥組。DADLE組在膿毒癥模型建立后立即按5 mL/kg的劑量腹腔注射DADLE溶液（濃度：0.5 mg/mL）進(jìn)行處理。各組制模后給予常規(guī)抗休克補(bǔ)液處理，制模后8 h將大鼠以頸椎脫臼法處死，取血及肝臟組織進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 肝臟線粒體制備

秤取10 g大鼠肝臟組織，迅速置于0℃分離液（含EDTA 1 mmol/L，蔗糖0.25 mol/L、Tris-HCl 5 mmol/L，pH7.4）， 間斷超聲勻漿3 min，將制備好的組織勻漿以2×103 r/min離心8 min，留取上清液，以1×104 r/min離心15 min，棄去上清液，以分離液將沉淀重懸浮，再次以1×104 r/min離心15 min，再次棄去上清液，最后以2 mL分離液吹打重懸浮所得沉淀，即線粒體懸液。所得線粒體懸液內(nèi)蛋白濃度以雙縮脲法測定，再用分離液調(diào)整到合適濃度備用。

1.3 大鼠肝臟線粒體呼吸耗氧功能的測定

RCR=ADP啟動（加入ADP 時）的態(tài)3呼吸速率/線粒體琥珀酸啟動（ADP 耗竭后）的態(tài)4呼吸速率。態(tài)3呼吸速率和態(tài)4呼吸速率采用Clark氧電極技術(shù)測定。反應(yīng)體系總體積3 mL，pH 7.35～7.45，包含：KCl 0.01 mol/L、MgCl2 5 mmol/L、琥珀酸0.2 mol/L、Tris-HCl 0.01 mol/L、蔗糖0.25 mmol/L、KH2PO4 5 mmol/L、ADP 加入濃度為0.33 mmol/L，線粒體蛋白濃度為1 g/L，計(jì)算呼吸控制率（respiratory control ratio，RCR）、磷/氧化（ADP/O）。

1.4 血清AST、ALT測定

采用美國貝克曼奧林巴斯AU680全自動生化分析儀檢測大鼠血清AST、ALT水平，所需試劑由該公司提供。

1.5 大鼠肝臟組織AMP、ADP、ATP含量測定

稱取30 mg大鼠肝臟組織放入0.5 mL冷卻的10% HClO4中，在冰浴下間斷超聲勻漿3 min，并迅速制成20% 的勻漿液。將制備的肝臟組織勻漿液在4℃下以8×103 r/min離心min，留取上清液，置4℃ 冰箱保存待檢。

高效液相色譜儀（HPLC）系統(tǒng)購自美國Waters 公司，包括： 486型高效液相色譜儀，510型自動進(jìn)樣泵和Millenium數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)。色譜條件預(yù)柱為Nova-pak C18（3.9×150 mm，3.5 μm），流動相為NH4H2PO4緩沖液（濃度為0.1 mol/L，pH值為5.3），流速為0.9 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，紫外線檢測波長為254 nm，靈敏度為0.01 AUFS，柱溫為室溫。

將AMP、ADP及ATP標(biāo)準(zhǔn)品（購自美國Sigma公司）分別配制成濃度梯度為0.0100 mmol/L、0.0200 mmol/L、0.0625 mmol/L和0.1250 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)液，取20 μL標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)樣，計(jì)算并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。將檢測樣品獲得的AMP、ADP及ATP峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品峰面積相比，計(jì)算大鼠肝臟組織ATP、ADP及AMP的含量[μmol/（g·wet）]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織AMP、ADP、ATP含量和血清ALT、AST水平的變化

與SO組比較，SEP組和DADLE組ATP含量均明顯降低（P<0.05），而DADLE組肝臟ATP含量較SEP組明顯升高（P<0.05）。與SO組比較，SEP組和DADLE組血清ALT和AST 水平均明顯升高（P<0.05），而DADLE組則明顯低于SEP組（P<0.05），見表1。

2.2 各組大鼠肝臟線粒體呼吸功能的變化

與SO組比較，SEP組、DADLE組的RCR和ADP/O均明顯降低（P<0.05），而態(tài)3呼吸速率和態(tài)4呼吸速率明顯升高（P<0.05）；而DADLE組與SEP組比較，RCR和ADP/O明顯提高（P<0.05），態(tài)3呼吸速率和態(tài)4呼吸速率明顯降低（P<0.05），提示膿毒癥時肝線粒體呼吸速率明顯受到抑制，DADLE處理后顯著改善了線粒體的呼吸速率，見表2。

3 討論

雖然當(dāng)前針對膿毒癥的研究已取得了很大進(jìn)展[7]，但其發(fā)展過程中多器官功能障礙綜合征（MODS）的機(jī)制仍不明確。膿毒癥的一個主要特征是細(xì)胞病理性缺氧及氧利用障礙，導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化障礙、能量產(chǎn)生下降[8]。膿毒癥時由于炎癥因子大量釋放、氧自由基水平升高和鈣超載導(dǎo)致早期即可出現(xiàn)肝臟氧供需失衡、肝細(xì)胞能量代謝和內(nèi)環(huán)境紊亂[9-11]，而導(dǎo)致急性肝損害甚至肝功能衰竭。本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，CLP制模后8 h血清ALT、AST水平明顯升高，表明肝臟在膿毒癥早期就已經(jīng)受到累及，且反應(yīng)劇烈，炎癥造成大量肝細(xì)胞死亡，從而導(dǎo)致不同程度的肝損傷。本研究中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過DADLE處理，DADLE組大鼠血清ALT和AST水平明顯低于膿毒癥組，說明DADLE能明顯減輕膿毒癥對大鼠肝臟的損害，改善肝功能。

線粒體是一個細(xì)胞器，它是細(xì)胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，最基本的功能是通過氧化磷酸化過程將ADP、AMP轉(zhuǎn)換為ATP，而且線粒體在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等方面也起著至關(guān)重要的作用。線粒體損傷一般都表現(xiàn)為線粒體形態(tài)腫脹、內(nèi)、外膜完整性破壞、嵴紊亂，形態(tài)學(xué)定量分析發(fā)現(xiàn)嵴的膜表面密度和膜間空隙明顯增加，基質(zhì)密度降低。另外，線粒體內(nèi)膜和外膜受損機(jī)制不盡相同，內(nèi)膜受損可能與線粒體MPTP開放有關(guān)，而外膜受損可能與線粒體通透轉(zhuǎn)換無關(guān)，初步證據(jù)顯示Bax可能參與外膜損害[12]。因此在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染等病理情況下，一旦線粒體膜結(jié)構(gòu)和功能受到破壞[13]，可引起細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂，甚至引起細(xì)胞死亡，因此以線粒體為靶向的治療逐漸受到關(guān)注。

RCR 與ADP/O比值一起，是用來衡量線粒體結(jié)構(gòu)功能完整與否及氧化磷酸化偶聯(lián)程度的靈敏指標(biāo)。RCR值為ADP啟動的態(tài)3呼吸速率與琥珀酸啟動的態(tài)4呼吸速率的比值； ADP/O值是指線粒體每吸收一克原子氧的同時，生成ATP 的克分子數(shù)的比值，它反映線粒體的能量轉(zhuǎn)化效率。ADP/O降低代表氧化磷酸化能量生成脫耦連，合成ATP 的能力下降。本研究通過檢測RCR（呼吸控制率）和ADP/O來反映線粒體的呼吸功能及合成ATP的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時肝臟ATP含量下降，RCR和ADP/O均明顯降低，提示線粒體功能受損，肝臟能量代謝紊亂。DADLE是一種非選擇性δ阿片受體激動劑，我們以往的研究已經(jīng)證明其能明顯改善膿毒癥大鼠的存活率[14，15]，在本研究中DADLE處理組肝ATP含量較SEP組明顯升高，同時RCR和ADP/O也有明顯提高，這表明DADLE對膿毒癥大鼠肝臟線粒體呼吸功能具有保護(hù)作用，從而改善了肝細(xì)胞在膿毒癥缺氧狀態(tài)下的能量代謝。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Crouser ED. Mitochondrial dysfunction in septic shock and multiple organ dysfunction syndrome[J]. Mitochondrion，2004， 4（5-6）：729-741.

[2] 龔平，李春盛. 膿毒癥和線粒體功能障礙[J]. 中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2013，25（4）：254-256.

[3] 陶珮，尹海燕，馬永輝. 姜黃素對膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換的作用機(jī)制研究[J]. 中華危重病急救醫(yī)學(xué)，2014，26（9）：666-670.

[4] Deutschman CS，Cereda M，Ochroch EA，et al. Sepsis-induced cholestasis，steatosis，hepatocellular injury，and impaired hepatocellular regeneration are enhanced in interleukin-6 -/- mice[J]. Crit Care Med，2006，34（10）：2613-2620.

[5] 張杰，劉歆農(nóng)，張培建，等. 白術(shù)多糖預(yù)處理對大鼠肝臟缺血再灌注損傷后肝細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的影響[J]. 肝膽胰外科雜志，2011，23（1）：4-6.

[6] Wichterman KA，Baue AE，Chaudry IH. Sepsis and septic shock-a review of laboratory models and a proposal[J]. The Journal of Surgical Research，1980，29（2）：189-201.

[7] 李志軍，王東強(qiáng)，田永超，等. 2010德國膿毒癥指南解讀——關(guān)于膿毒癥的預(yù)防、診斷、治療及后續(xù)護(hù)理[J]. 中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2011，23（5）：257-262.

[8] Exline MC，Crouser ED. Mitochondrial dysfunction during sepsis：Still more questions than answers[J]. Critical care medicine，2011，39（5）：1216-1217.

[9] Albuszies G，Radermacher P，Vogt J，et al. Effect of increased cardiac output on hepatic and intestinal microcirculatory blood flow，oxygenation，and metabolism in hyperdynamic murine septic shock[J]. Crit Care Med，2005， 33（10）：2332-2338.

[10] Sakaguchi S，F(xiàn)urusawa S. Oxidative stress and septic shock：metabolic aspects of oxygen-derived free radicals generated in the liver during endotoxemia[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，2006，47（2）：167-177.

[11] Shilo S，Aronis A，Komarnitsky R，et al. Selenite sensitizes mitochondrial permeability transition pore opening in vitro and in vivo：A Possible mechanism for chemo-protection[J]. The Biochemical Journal，2003，370（Pt 1）：283-290.

[12] Crouser ED，Julian MW，Huff JE，et al. Abnormal permeability of inner and outer mitochondrial membranes contributes independently to mitochondrial dysfunction in the liver during acute endotoxemia[J]. Critical Care Medicine，2004，32（2）：478-488.

[13] Garrabou G，Moren C，Lopez S，et al. The effects of sepsis on mitochondria[J]. The Journal of Infectious Diseases， 2012，205（3）：392-400.

[14] 馮文明，鮑鷹，朱鳴，等. δ阿片受體激動劑對膿毒癥大鼠血液動力學(xué)和氧代謝的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志，2011，31（4）：491-493.

[15] Tang CW，F(xiàn)eng WM，Du HM，et al. Delayed administration of D-Ala2-D-Leu5-enkephalin，a delta-opioid receptor agonist，improves survival in a rat model of sepsis[J].The Tohoku Journal of Experimental Medicine，2011，224（1）：69-76.

（收稿日期：2015-01-22）