萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用研究

王朝暉 婁曉輝 余一駿 鄭海軍

[摘要] 目的 探討萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用。 方法 參照feeney法自由落體致傷法制作創(chuàng)傷性腦損傷模型，大鼠分為對照組、模型組、SFN組及協(xié)同組，每組各15只，對照組不進(jìn)行撞擊實驗，SFN組術(shù)后每日給予萊菔硫烷腹腔注射，協(xié)同組給予萊菔硫烷與氯化鋰腹腔注射，模型組每日腹腔注射等量生理鹽水，比較術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d各組大鼠神經(jīng)功能缺失程度評分（mNSS）及術(shù)后7 d各組大鼠腦組織含水量、腦組織HE染色結(jié)果以及腦組織中SOD活性、IL-6、TNF-α、MDA水平。 結(jié)果 模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，各時間點mNSS評分均顯著升高（P<0.05）；術(shù)后5 d、術(shù)后7 d，SFN組及協(xié)同組大鼠mNSS評分顯著低于模型組（P<0.05），且協(xié)同組mNSS評分顯著低于SFN組（P<0.05）；術(shù)后7 d，對照組大鼠腦組織含水量為（69.29±2.06）%，模型組為（75.40±1.73）%，SFN組為（73.08±1.06）%，協(xié)同組為（71.27±1.52）%。各組大鼠腦組織HE染色結(jié)果顯示，SFN組及協(xié)同組其神經(jīng)細(xì)胞的損傷較模型組明顯減輕，細(xì)胞壞死有所減少，且以協(xié)同組神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕最為顯著。模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05）。 結(jié)論 萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕大鼠腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞損傷、抑制氧化應(yīng)激以及炎癥因子的釋放有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 萊菔硫烷；氯化鋰；創(chuàng)傷性腦損傷；神經(jīng)保護(hù)

[中圖分類號] R651.15 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）19-0026-04

創(chuàng)傷性腦損傷（traumtic brain injury，TBI）是一種病情嚴(yán)重的機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，同時也是目前導(dǎo)致青壯年死亡以及致殘的一個主要病因[1]。TBI能夠直接破壞大腦神經(jīng)細(xì)胞以及腦血管結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致患者神經(jīng)功能出現(xiàn)嚴(yán)重的損害，TBI激發(fā)的腦水腫、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、血-腦屏障通透性改變以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡等病理變化可進(jìn)一步加重對機(jī)體腦組織的損害，因此改善TBI患者的預(yù)后一直是廣大研究者共同關(guān)注的課題[2]。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一種異硫氰酸鹽，主要存在于十字花科植物當(dāng)中，其中以西蘭花的含量最多[3]。近年來，關(guān)于SFN抗癌以及細(xì)胞保護(hù)性能已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點；而鋰鹽作為一種抗抑郁-躁狂癥的藥物在臨床中應(yīng)用，近些年來[4，5]，通過體內(nèi)、體外實驗研究均表明鋰鹽能夠有效抑制各種因素所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。對于萊菔硫烷聯(lián)合鋰鹽對腦損傷作用的研究，目前尚無相關(guān)報道。本研究探討萊菔硫烷協(xié)調(diào)氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇清潔級Wistar雄性大鼠60只，實驗動物由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。分籠進(jìn)行飼養(yǎng)，給予大鼠自由進(jìn)食與自由飲水，制備腦創(chuàng)傷模型前12 h禁食。

1.2 主要儀器與試劑

低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Olympus光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，IX-71）；牙科臺式電鉆（寧波醫(yī)療器械公司）；石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）；恒冷冰凍切片機(jī)（德國Leica公司）。

萊菔硫烷（美國Calbiochem公司）；氯化鋰（廣東西隴化工廠提供，分析純）；SOD檢測試劑盒（南京建成試劑公司）；MDA檢測試劑盒（南京建成試劑公司）；IL-6檢測試劑盒（上海豐翔生物科技有限公司）；TNF-α（上海豐翔生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 大鼠TBI模型 參照feeney法[6]自由落體致傷的原理制備中度TBI大鼠模型。使用腹腔注射水合氯醛（10%，300 mg/kg）麻醉，待麻醉滿意后，將大鼠仰臥固定，頭頂部備皮，使用常規(guī)碘伏消毒，沿大鼠正中線切開頭皮約2.5 cm，將骨膜剝離，暴露出右頂骨。使用牙科臺式電鉆于中線右側(cè)旁2.5 mm、冠狀縫后1.5 mm處鉆一個直徑約為5 mm的骨窗，注意保持硬腦膜的完整，以0.048 N·s（20 g重錘、30 cm高度）的沖擊力撞擊右側(cè)腦部中央前回皮層，然后再使用骨蠟將鉆孔封閉，縫合切口，消毒。打擊有效的標(biāo)準(zhǔn)為撞桿打擊之后，能夠保證硬腦膜的完整性，并且出現(xiàn)局部的腦組織膨隆。術(shù)后給予大鼠4萬單位的硫酸慶大霉素肌肉注射，以預(yù)防感染發(fā)生。對照組大鼠接受同樣的手術(shù)操作，但是并不進(jìn)行沖擊處理。剔除造模不成功或者意外死亡的大鼠，然后用同一批次的大鼠補(bǔ)足。

1.3.2 分組及給藥方法 將60只大鼠分為4組，每組15只，分別為對照組、模型組、SFN組、協(xié)同組。術(shù)后即刻，SFN組給予5 mg/kg SFN腹腔注射，協(xié)同組給予5 mg/kg SFN以及30 mg/kg氯化鋰腹腔注射，對照組給予等體積的生理鹽水腹腔注射，之后每天注射1次，共注射5 d。

1.4 評價指標(biāo)

1.4.1 神經(jīng)功能恢復(fù)評價 采用改良神經(jīng)功能缺失程度評分（modified neurological severity score，mNSS）標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分。各組大鼠均在術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d通過感覺、運動、反射活動以及平衡木測試等對大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評分，比較各組大鼠不同時間的神經(jīng)功能總分，總分最低為0分，最高為18分，分?jǐn)?shù)越低則表示大鼠的神經(jīng)功能恢復(fù)越好。

1.4.2 腦組織含水量測定 實驗動物術(shù)后第7天，每組大鼠中任取5只，腹腔注射10%水合氯醛2 mL過量麻醉，將其采用斷頭法處死，以打擊灶作為中心，取大鼠損傷側(cè)大約500 mg腦組織，去除凝血后，用冰冷的生理鹽水將腦組織表面的血跡沖洗干凈，然后用濾紙吸取表面殘余的水分，測量其濕重，然后將其置于60℃的烘箱內(nèi)烘烤96 h，取出后稱量其干重，計算各組大鼠腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.4.3 腦組織HE染色 各組大鼠分別于術(shù)后7 d隨機(jī)抽取5只大鼠，按照上述方法處死，取其腦組織，取出小腦以及低位腦干，以損傷中心為標(biāo)準(zhǔn)，冠狀位切開腦組織，然后立即浸入福爾馬林溶液當(dāng)中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋。HE染色步驟：石蠟切片（厚度為4 μm）→二甲苯脫蠟→梯度酒精脫水→蒸餾水洗→蘇木素染細(xì)胞核→蒸餾水洗→鹽酸酒精分化→氨水細(xì)胞核返藍(lán)→伊紅染細(xì)胞漿→梯度酒精脫水→二甲苯透明→封片→觀察、拍照。

1.4.4 腦組織SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量測定 術(shù)后7 d按照上述方法每組處死5只大鼠，取其腦組織，用生理鹽水沖洗后，吸取表面水分，取打擊灶為中心的腦組織約220 g，用電子天平精確測量重量后加入約9倍體積的PBS，制作成損傷大腦皮層的勻漿，并記錄勻漿總體積（mL）。將其離心20 min（4000 r/min），取其上清液，分裝后置于-80℃冰箱內(nèi)備用檢測。各組大鼠腦組織SOD活性、IL-6、TNF-α以及MDA含量測定參照試劑盒使用說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對本研究數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，檢驗水平為α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)評分（mNSS）比較

造模后可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失，且術(shù)后1 d以及術(shù)后3 d大鼠神經(jīng)功能的缺失最為嚴(yán)重，模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，各時間點mNSS評分均顯著升高（P<0.05）；術(shù)后5 d、術(shù)后7 d，SFN組以及協(xié)同組大鼠mNSS評分顯著低于模型組（P<0.05），且協(xié)同組mNSS評分顯著低于SFN組（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)評分（mNSS）比較（x±s，分）

注：與同期對照組比較，*P<0.05；與同期模型組比較，#P<0.05；與同期SFN組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較

術(shù)后7 d，對照組大鼠腦組織含水量為（69.29±2.06）%，模型組大鼠腦組織含水量為（75.40±1.73）%，SFN組大鼠腦組織含水量為（73.08±1.06）%，協(xié)同組大鼠腦組織含水量為（71.27±1.52）%。見圖1。

2.3 各組大鼠腦組織HE染色

各組大鼠腦組織HE染色見圖2，對照組大鼠腦組織無損傷，顯示其皮層神經(jīng)結(jié)構(gòu)完整，腦組織細(xì)胞數(shù)量多，可見明顯的核仁；模型組大鼠損傷區(qū)腦皮層結(jié)構(gòu)不完整，且無明顯核仁，在損傷中心可見細(xì)胞溶解、壞死以及軟化灶的形成；SFN組以及協(xié)同組神經(jīng)細(xì)胞的損傷較模型組明顯減輕，細(xì)胞壞死有所減少，在創(chuàng)傷周邊可以看到新生增殖的組織，且以協(xié)同組神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕最為顯著。

圖2 各組大鼠腦組織HE染色表現(xiàn)（×400）

（①對照組；②模型組；③SFN組；④協(xié)同組）

2.4 各組大鼠腦組織SOD、IL-6、TNF-α以及MDA水平比較

模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05）。見表2。

3 討論

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）是臨床中導(dǎo)致患者死亡和致殘的一個主要疾病，嚴(yán)重的TBI患者大多遺留有認(rèn)知記憶功能的障礙以及感覺、運動功能的缺損。大量的相關(guān)研究顯示[7]，腦損傷后所繼發(fā)的腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、神經(jīng)炎癥反應(yīng)等均可能再次加重腦組織損傷，甚至導(dǎo)致患者死亡。迄今為止，除常規(guī)的手術(shù)緩解患者腦水腫所引起的顱內(nèi)壓升高外，仍然沒有有效的方法提高患者的神經(jīng)功能恢復(fù)。大量研究結(jié)果顯示[8，9]，機(jī)體腦損傷后，產(chǎn)生出大量的氧自由基，一方面蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等大分子物質(zhì)發(fā)生氧化損傷直接破壞細(xì)胞膜以及其他細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，另一方面則刺激細(xì)胞因子以及相關(guān)粘附因子的表達(dá)，從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腦組織損傷加重；此外，通過抑制線粒體功能等間接途徑，氧自由基能夠激動凋亡信號通路，從而引起細(xì)胞凋亡。氧自由基在繼發(fā)性腦損傷病理機(jī)制當(dāng)中起到了非常重要的作用，因此，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及清除氧自由基可能是治療TBI的一個重要思路。

萊菔硫烷（SFN）是一種異硫氰酸鹽，主要存在于十字花科植物當(dāng)中，研究顯示[10]，SFN具有顯著的抗腫瘤及抗氧化生物學(xué)特性。近些年來，隨著對萊菔硫烷研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)萊菔硫烷對腦出血、腦部嚴(yán)重、急性腎功能衰竭、心臟缺血再灌注等均具有良好的保護(hù)作用[11，12]。目前體內(nèi)外實驗結(jié)果顯示，萊菔硫烷能夠有效緩解機(jī)體由于氧化應(yīng)激對組織以及細(xì)胞的損傷，是一種具有良好前景的抗氧化劑。

近些年來，鋰對于腦缺血的保護(hù)作用受到了研究者的關(guān)注，已有研究證實氯化鋰能夠有效減輕由于沙土鼠前腦缺血后導(dǎo)致的海馬區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡[13]。Chuang等[14]對大鼠局灶性腦缺血模型研究中發(fā)現(xiàn)，皮下注射（0.5～3.0）mEq/kg氯化鋰能夠有效減少腦缺血后大鼠腦梗死的體積，且呈劑量依賴性。劉安民等研究顯示[15]，氯化鋰對于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與上調(diào)HSP70蛋白、抑制谷氨酸誘導(dǎo)的MAPL激活有關(guān)。針對萊菔硫烷與氯化鋰不同的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，猜想二者聯(lián)合運用是否具有協(xié)同作用，故本研究探討萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對TBI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，術(shù)后SFN組大鼠以及協(xié)同組大鼠其mNSS評分較模型組顯著降低，且協(xié)同組顯著低于SFN組，表明萊菔硫烷能夠?qū)BI大鼠起到顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，且SFN與氯化鋰聯(lián)合運用，其神經(jīng)保護(hù)作用更為顯著，提示二者對TBI大鼠神經(jīng)保護(hù)具有協(xié)同作用。從腦組織含水量來看，術(shù)后7 d各TBI大鼠腦組織含水量增加，而SFN組、協(xié)同組腦組織含水量較模型組有所降低，且協(xié)同組低于SFN組；從腦組織HE染色結(jié)果來看，運用SFN治療以及協(xié)同治療后，能夠有效減輕TBI大鼠神經(jīng)細(xì)胞的損傷，且協(xié)同組作用更為顯著；從氧化應(yīng)激以及炎癥因子水平來看，模型組、SFN組、協(xié)同組與對照組比較，SOD活性顯著下降（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著上升（P<0.05）；SFN、協(xié)同組與模型組比較，SOD活性顯著上升（P<0.05），IL-6、TNF-α、MDA水平顯著下降（P<0.05），且協(xié)同組IL-6、TNF-α水平顯著低于SFN組（P<0.05），表明SFN協(xié)同氯化鋰能夠有效減輕TBI大鼠的腦水腫、減輕大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷、清除氧自由基、降低炎癥因子水平。

綜上所述，萊菔硫烷協(xié)同氯化鋰對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與減輕大鼠腦水腫、神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制氧化應(yīng)激以及炎癥因子的釋放有關(guān)，而具體的作用通路還需要進(jìn)一步深入研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 丁軍，陳世文，郭衍，等. 創(chuàng)傷性腦損傷后顱內(nèi)進(jìn)展性出血危險因素分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2010， 30（7）：829-831.

[2] 周保純，劉兵，楊曉梅，等. 創(chuàng)傷性腦損傷患者亞急性期無創(chuàng)監(jiān)測腦組織氧飽和度變化及影響因素[J]. 中國急救醫(yī)學(xué)，2014，（11）：996-998.

[3] Naumann P，F(xiàn)ortunato F，Zentgraf H，et al. Autophagy and cell death signaling following dietary sulforaphane act independently of each other and require oxidative stress in pancreatic cancer[J]. International Journal of Oncology，2011， 39（1）：101-109.

[4] 鄧許勇. 氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞及脊髓去細(xì)胞支架移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實驗研究[D]. 南方醫(yī)科大學(xué)，2010.

[5] 鄧立慶，譚振，康鵬德，等. 鋰鹽促進(jìn)成骨機(jī)制及研究現(xiàn)狀[J]. 中國矯形外科雜志，2014，22（3）： 241-244.

[6] 顧兵，金建波，孟瑋，等. 創(chuàng)傷性腦損傷動物模型及其實驗治療學(xué)應(yīng)用[J]. 中國藥理學(xué)通報，2010，26（3）：285-289.

[7] Ramlackhansingh AF，Brooks DJ，Greenwood R J，et al. Inflammation after trauma： Microglial activation and traumatic brain injury[J]. Annals of Neurology，2011，70（3）： 374-383.

[8] Giacino JT，Whyte J，Bagiella E，et al. Placebo-controlled trial of amantadine for severe traumatic brain injury[J]. New England Journal of Medicine，2012，366（9）：819-826.

[9] 夏磊，姜正林，王國華，等. 人參總皂苷對腦外傷大鼠腦組織氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011， 21（19）：2219-2222.

[10] Nallasamy P，Babu P V A，Shah H，et al. Sulforaphane at physiological concentrations inhibits TNF-α-induced monocyte adhesion to human vascular endothelial cells and improves vascular inflammation in mice through a nuclear factor-κB-mediated mechanism[J]. Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2014，34（1）： A457-A457.

[11] Liu H，Talalay P. Relevance of anti-inflammatory and antioxidant activities of exemestane and synergism with sulforaphane for disease prevention[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（47）：19065-19070.

[12] Choi Y H. Induction of reactive oxygen species-dependent mitotic arrest and apoptosis by sulforaphane in human bladder cancer 5637 cells[J]. Cancer Research，2014， 74（19）：5106-5106.

[13] 卞清明，錢燕寧. 氯化鋰對沙土鼠前腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及磷酸化Akt蛋白表達(dá)的影響[J]. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，25（8）：540-543.

[14] Chuang D M，Chen R W，Chalecka-Franaszek E，et al. Neuroprotective effects of lithium in cultured cells and animal models of diseases[J]. Bipolar disorders，2002，4（2）：129-136.

[15] 劉安民，麥榮康，蔡望青，等. 氯化鋰預(yù)處理對腦出血后血腫周圍神經(jīng)細(xì)胞凋亡及核因子κB表達(dá)的抑制作用[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2009，8（8）：798-801，809.

（2015-01-27）