Wnt信號(hào)激活劑氯化鋰抑制脂肪細(xì)胞分化的研究

張娜 潘桂梅 楊娜 黃麗芳 劉文勵(lì)

【摘要】目的證實(shí)Wnt信號(hào)激活劑（氯化鋰）可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）向脂肪細(xì)胞分化的作用。方法體外培養(yǎng)Balb/c小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞分化，再用Wnt信號(hào)激活劑氯化鋰干預(yù)，用油紅O染色觀察脂肪細(xì)胞的形成，RT-PCR檢測(cè)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中脂肪細(xì)胞PPAR-γ和成骨細(xì)胞Runx-2相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)論Wnt信號(hào)激活劑氯化鋰可以抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。

【關(guān)鍵詞】Wnt信號(hào)激活劑；氯化鋰；基質(zhì)干細(xì)胞

062文章編號(hào)：1004-7484（2014）-06-3056-02

有研究證實(shí)Wnt信號(hào)可以抑制基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路是Wnt蛋白可以結(jié)合Frizzled受體家族。這些受體的活化使通路中的關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白（β-catenin）在胞漿中穩(wěn)定并累積，然后進(jìn)入胞核與TCF/Lef轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而誘導(dǎo)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。通常，在沒有Wnt信號(hào)的情況下，β-catenin不斷地被降解復(fù)合物（APC/Axin/GSK-3β）中的GSK-3β在其氨基末端磷酸化，從而被蛋白酶降解。這樣，可以通過抑制GSK-3β使β-catenin在胞漿中積聚從而間接達(dá)到Wnt信號(hào)活化效應(yīng)。所以本試驗(yàn)選擇了GSK-3β的抑制劑氯化鋰（LiCl）來進(jìn)行研究。又因?yàn)樵僬鲜且环N器官特異性的自身免疫性疾病，環(huán)孢素A作為非細(xì)胞特異性的免疫抑制劑，是臨床治療再障的基本藥物。該實(shí)驗(yàn)為氯化鋰聯(lián)合環(huán)孢素A治療再障提供理論基礎(chǔ)，以達(dá)到更好的臨床治療效果。

1資料與方法

1.1一般資料動(dòng)物：雌性Balb/c小鼠（H-2d）8-12周齡，18-22克，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2藥品及試劑氯化鋰、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX）均購自美國(guó)Sigma公司，胰酶粉劑、油紅O購自美國(guó)Amerisco公司，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑、TRIzol試劑購自TaKaRa公司。L-DMEM培養(yǎng)基為美國(guó)HyClone-Pierce公司產(chǎn)品。

1.3試劑配制油紅O染液的配制：油紅O干粉0.4g加入10mL異丙醇充分溶解，干液室溫保存。干液和三蒸水以3：2比例混合，過濾、取濾液作為新鮮染液。脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基1：10ml胎牛血清、1mg胰島素、0.1μmol地塞米松、0.05mmolIBMX、90mlL-DMEM。脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基2：10ml胎牛血清、1mg胰島素、90mlL-DMEM。紅細(xì)胞裂解液（Tris-NH4Cl）：NH4Cl3.735g加上450ml雙蒸水，Tris堿1.0297g加上50ml雙蒸水，兩者混勻，過濾除菌，待用。

1.4方法

1.4.1正常小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的培養(yǎng)正常小鼠拉頸處死，無菌取下股骨和脛骨，機(jī)械分離血管結(jié)締組織，PBS沖洗，用針頭在生長(zhǎng)端打孔，注射器將骨髓細(xì)胞吹入無血清DMEM培養(yǎng)基中并反復(fù)吸沖成單細(xì)胞懸液，離心1500r/min×10min。細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸后以20×107/瓶密度接種于100cm2培養(yǎng)瓶中。72h后首次半量換液，以后每3-4天換液一次。11d左右BMSCs約80%匯合，室溫條件下用0.25%的胰蛋白酶和0.02%EDTA按1：1混合消化分離細(xì)胞并傳代。

1.4.2定向誘導(dǎo)BMSCs向脂肪細(xì)胞分化第二繼代細(xì)胞以每毫升5×104個(gè)接種于6個(gè)培養(yǎng)皿中，分為對(duì)照組，脂肪細(xì)胞組和Licl抑制組。細(xì)胞達(dá)到80%匯合后對(duì)照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)液，脂肪細(xì)胞組換成脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基1，Licl抑制組換為脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基1并加入LiCl使其終濃度為20mmol/L。兩天后換液，對(duì)照組繼續(xù)加常規(guī)培養(yǎng)液，脂肪細(xì)胞組換為脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基2，Licl抑制組換為脂肪細(xì)胞分化培養(yǎng)基2再加LiCl使其終濃度為20mmol/L。兩天后，均換為常規(guī)培養(yǎng)液。于培養(yǎng)的第14天將各組細(xì)胞做油紅O染色，并取各組細(xì)胞約107個(gè)，各加入1mlTRIzol用于做RT-PCR。

1.4.3脂肪細(xì)胞的檢測(cè)每日通過倒置顯微鏡觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞，待分化后的脂肪細(xì)胞中脂肪顆粒較多較大時(shí)，即大約誘導(dǎo)分化的第14天左右，用油紅O染色，檢測(cè)脂肪細(xì)胞的數(shù)量，具體方法為：各組細(xì)胞用PBS沖洗3次，10%中性甲醛固定10min，油紅O染液浸染10min，60%異丙醇洗去多余染液，PBS沖洗3次，蘇木精復(fù)染3-5min，1%鹽酸稍分化，PBS漂洗10min，顯微鏡下觀察。

1.4.4RT-PCR檢測(cè)PPAR-γ和Runx-2的半定量表達(dá)將各組細(xì)胞中的培養(yǎng)液倒掉，各加入1mlTRIzol，吹打混勻后，各移入1.5ml的Eppendorf管中，按照說明書步驟提取RNA，然后在PCR儀上逆轉(zhuǎn)錄，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列為PPAR-γ上游5-3aagagctgacccaatggttg，下游5-3ggatccggcagttaagatca，產(chǎn)物長(zhǎng)度296；Runx-2上游5-3ggacgaggcaagagtttca下游5-3ggtggcagtgtcatcatctg，產(chǎn)物長(zhǎng)度465bp，擴(kuò)增條件：95℃變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃復(fù)性45秒，72℃延伸45秒，30個(gè)循環(huán)；72℃保溫10分鐘。擴(kuò)增后在瓊脂糖凝膠中電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶的深淺。

2結(jié)果

2.1正常小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞組BMSCs培養(yǎng)向脂肪細(xì)胞分化的第7天細(xì)胞中已開始出現(xiàn)脂肪小滴，隨后幾天脂肪滴逐漸增多，并相互融合，在誘導(dǎo)的第14天做油紅O染色，已形成脂肪細(xì)胞，如圖1右所示；而加入LiCl（抑制組）的基質(zhì)干細(xì)胞卻沒有向脂肪細(xì)胞分化，生長(zhǎng)如正?；|(zhì)細(xì)胞，如圖1左所示。

2.2各組細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)PPAR-γ和Runx-2基因表達(dá)的結(jié)果脂肪細(xì)胞組的細(xì)胞表達(dá)PPAR-γ比Licl抑制組強(qiáng)，而Licl抑制組表達(dá)Runx-2比脂肪細(xì)胞組強(qiáng)。這就證實(shí)了LiCl確實(shí)能抑制基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化（見圖2）。

3討論

3.1間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell）為中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞具有全能干細(xì)胞的特點(diǎn)，能進(jìn)行多向分化，目前主要來源為骨髓。國(guó)內(nèi)外已有大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓MSCs能分化為造血基質(zhì)，支持造血，還可向中胚層和外胚層來源的組織分化。目前認(rèn)為最有效的認(rèn)定是分離的細(xì)胞能被定向誘導(dǎo)分化為多種間充質(zhì)來源的組織細(xì)胞，即定向誘導(dǎo)分化為骨、脂肪、軟骨細(xì)胞是判定MSCs的標(biāo)志。所以我們的試驗(yàn)未通過分離細(xì)胞而是直接向貼壁的細(xì)胞中加入脂肪細(xì)胞分化液，通過細(xì)胞培養(yǎng)分化最終證實(shí)MSCs可以向脂肪細(xì)胞分化。而加入氯化鋰的細(xì)胞抑制組未見有脂肪細(xì)胞形成，且RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)脂肪細(xì)胞的相關(guān)基因PPAR-γ在加入氯化鋰后表達(dá)明顯減弱，這些結(jié)果充分證實(shí)了Wnt信號(hào)可以抑制基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。這也為環(huán)孢素A聯(lián)合氯化鋰治療再生障礙性貧血提供了理論基礎(chǔ)。

3.2Wnt信號(hào)與骨髓造血和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的作用在造血系統(tǒng)中，造血干細(xì)胞（HSC）及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞均表達(dá)Wnt蛋白。Wnt信號(hào)途徑被認(rèn)為在維持HSC自我更新方面有一定作用。轉(zhuǎn)導(dǎo)β—catenin可使HSC增殖并維持其表型，阻斷Wnt信號(hào)途徑可使HSC的體外增殖及體內(nèi)造血重建能力降低，純化的Wnt蛋白則能抑制HSC分化并增加其造血能力。此外，Wnt信號(hào)能抑制骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化，促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化。而成骨細(xì)胞對(duì)骨髓的造血有重要作用。該實(shí)驗(yàn)采用Wnt信號(hào)激活劑（氯化鋰）證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。

圖2 第1、2泳道為內(nèi)參β-actin，可見抑制組細(xì)胞和脂肪細(xì)胞組細(xì)胞的RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄很成功；3泳道為加入LiCl的抑制組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增PPAR-γ基因，4泳道為脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增PPAR-γ基因，可明顯看出抑制組的PPAR-γ基因表達(dá)明顯減低；5泳道為加入LiCl的抑制組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增Runx-2基因，6泳道為脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)組細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增Runx-2基因，可看出抑制組的Runx-2基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。

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