小型豬作為耳科新型動物模型在中國的建立與應(yīng)用

伊海金

耳科學(xué)是以研究聽覺與平衡系的重要學(xué)科，其常見疾病為耳聾與眩暈，我國目前有耳聾患者2 700萬人，其中聾啞人200多萬，并以每年3萬多的數(shù)量在增長；眩暈更是臨床常見的癥狀，眩暈的患病率為0.5%,約占內(nèi)科門診的5%、耳鼻咽喉科門診15%，70歲以上的男性及女性老人眩暈的發(fā)病率分別達(dá)47%和61%。耳聾及眩暈給個人、家庭及社會帶來巨大的痛苦和沉重負(fù)擔(dān)，加強(qiáng)耳科學(xué)的基礎(chǔ)與臨床研究，尤其是拓展耳聾及眩暈基礎(chǔ)研究，創(chuàng)新耳聾與眩暈的治療技術(shù)是解決上述問題的關(guān)鍵所在。醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究往往需要動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,動物模型在生物醫(yī)學(xué)研究中占有重要地位。因此，尋找合適的動物模型至關(guān)重要。

動物模型指用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)動物，以進(jìn)行相關(guān)疾病及其他科學(xué)問題研究，目前嚙齒類動物應(yīng)用最為廣泛。嚙齒類動物模型存在的主要問題是與人親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其遺傳、體型以及壽命與人類存在較大差異[1]，限制了在人類疾病、藥物開發(fā)以及治療方面的應(yīng)用。非人類靈長類動物與人類親緣關(guān)系近，但存在倫理問題，并且應(yīng)用費(fèi)用昂貴、技術(shù)復(fù)雜、資源匱乏[1]。大量研究表明，豬與人的氨基酸同源性達(dá)84.1%，在解剖結(jié)果、生理代謝以及疾病發(fā)生機(jī)理上與人有很多相似之處[2]，目前在動物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用日趨廣泛。

1 豬及小型豬動物模型在醫(yī)學(xué)及耳科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用概述

以豬作為人類疾病動物模型的研究目前主要包括循環(huán)系統(tǒng)疾病、器官移植、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、糖尿病、皮膚病、遺傳性疾病及腫瘤等領(lǐng)域，對于開展醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究及創(chuàng)新臨床新技術(shù)應(yīng)用發(fā)揮重要作用[3-4]。尤其是自1949年明尼蘇達(dá)州小型豬在Hormel研究所應(yīng)用以來[5]，因其體型較小，操作方便，具有與人類在基因、解剖和生理上的相似性以及經(jīng)濟(jì)學(xué)、倫理學(xué)方面的優(yōu)勢，小型豬作為大型動物模型已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[6]。

在耳科學(xué)領(lǐng)域，新西蘭兔、豚鼠、沙鼠等小型哺乳動物都是傳統(tǒng)的耳科實(shí)驗(yàn)動物模型[7-10]，其中常用動物模型是嚙齒類動物，因其體型及內(nèi)耳體積較小，發(fā)育成熟晚，解剖結(jié)構(gòu)與人類差異較大，阻礙了此類動物模型在耳科領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。由于豬與人類存在諸多相似性，諸多學(xué)者開始初步探索豬在耳科動物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。Ikarashi等[11-12]以豬為模型進(jìn)行了中耳炎與乳突氣化之間相關(guān)性研究，也有部分學(xué)者應(yīng)用豬模擬人類中耳手術(shù)進(jìn)行中耳手術(shù)教學(xué)訓(xùn)練[13-14]。此外，還有學(xué)者對豬聽覺功能的初步研究，Hansen等人[15]在1992年研究高膽紅素血癥對新生仔豬聽覺誘發(fā)電位的影響，在實(shí)驗(yàn)過程中清晰的記錄到新生豬仔聽覺腦干反應(yīng)。與在其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用相比，豬在耳科動物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用并沒有形成體系，而且應(yīng)用對象僅限于家豬，在世界范圍內(nèi)沒有應(yīng)用小型豬耳科動物模型的報道。

2 小型豬耳科動物模型在中國的建立及應(yīng)用

國內(nèi)關(guān)于小型豬在耳科領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用主要集中在中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科楊仕明、郭維維團(tuán)隊(duì)，該團(tuán)隊(duì)通過創(chuàng)新研究，在國際上率先提出并證明了小型豬是耳科疾病研究最為理想的實(shí)驗(yàn)動物，并系統(tǒng)應(yīng)用小型豬開展耳聾及眩暈發(fā)病機(jī)制、新型治療技術(shù)實(shí)驗(yàn)研究，為耳聾及眩暈基礎(chǔ)研究開創(chuàng)新領(lǐng)域。

2.1 小型豬耳部形態(tài)學(xué)、發(fā)育學(xué)、聽力學(xué)和前庭功能及電生理研究為小型豬耳科動物模型建立奠定基礎(chǔ)

2.1.1 小型豬顳骨及耳部顯微解剖 通過對小型豬顳骨及耳部進(jìn)行顯微解剖研究，目前已證實(shí)小型豬顳骨結(jié)構(gòu)中的中耳、內(nèi)耳、面聽神經(jīng)及外側(cè)隱窩和人類耳部具有高度相似性。通過對小型豬的外耳、中耳、內(nèi)耳及外側(cè)隱窩的形態(tài)觀察和數(shù)據(jù)測量發(fā)現(xiàn)[16-17]：小型豬的中耳包括鼓室6壁，其上壁、外壁、內(nèi)壁、前壁與人類似，下壁為乳突，后壁為半規(guī)管，與人類不同，鼓室內(nèi)聽骨、面神經(jīng)及其分支的位置、毗鄰均類似人類；小型豬耳蝸為3轉(zhuǎn)半，除此不同之處以外，其耳蝸、前庭及半規(guī)管的形態(tài)、位置均與人類相似；小型豬的腦干耳蝸核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及毗鄰，包括外側(cè)隱窩、脈絡(luò)叢及聽面束等神經(jīng)的形態(tài)、位置及毗鄰與人類類似，其Luschka孔位于絨球、二腹葉和舌咽神經(jīng)根部圍成的三角形內(nèi)[16-17]。另外，侯昭暉等[18]通過對小型豬咽鼓管的研究也證實(shí)小型豬是咽鼓管研究的理想動物模型。

2.1.2 小型豬內(nèi)耳形態(tài)及發(fā)育豬耳蝸感覺上皮的分化首先從底圈開始，再到蝸管中部，然后逐漸向頂圈進(jìn)行，這與人類耳蝸發(fā)育及功能的建立具有相似性[19]。通過形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：耳蝸螺旋器和螺旋神經(jīng)節(jié)的結(jié)構(gòu)與人類相似，豬的螺旋器包含毛細(xì)胞、柱細(xì)胞、Deiters'細(xì)胞、Hensen's細(xì)胞、B?ttcher細(xì)胞（人類除外）和內(nèi)外溝細(xì)胞。另外，豬耳蝸具有與人類相似的4排毛細(xì)胞的排列方式，不同之處在于頂回毛細(xì)胞的靜纖毛呈束狀排列且較長；其前庭毛細(xì)胞呈樹枝狀排列，并且有耳石覆蓋[20]。以上研究證實(shí)，小型豬內(nèi)耳的發(fā)育與形態(tài)學(xué)與人類極其類似。

2.1.3 小型豬聽覺與前庭電生理在對小型豬形態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)之上，通過研究小型豬聽閾及敏感聽力范圍發(fā)現(xiàn)：小型豬與人類聽性腦干電位的特性比較發(fā)現(xiàn)豬都可以分化出7個波，但豬以Ⅱ波和Ⅴ波最顯著，人以Ⅴ波最顯著，其ABR波形、潛伏期與人極為相似[21-22]，嚙齒類的動物只能分化出Ⅰ～Ⅴ波，說明在整個聽覺傳導(dǎo)通路上，豬與人有相似的神經(jīng)核團(tuán)，而鼠有所缺失。同時對小型豬的耳蝸內(nèi)電位進(jìn)行測試，為今后以小型豬為模型進(jìn)行耳科疾病的外科治療實(shí)驗(yàn)及電生理測試奠定基礎(chǔ)。另外對前庭系統(tǒng)也進(jìn)行系統(tǒng)研究[23-24]，探索小型豬肌源性誘發(fā)前庭電位的最佳檢測方法，并得出結(jié)論，小型豬頸部伸肌和咬肌在強(qiáng)聲下誘發(fā)的肌源性電位潛伏期和閾值均一致，其咬肌位置表淺，便于定位，更易于肌源性誘發(fā)電位的記錄。以上研究為通過小型豬開展前庭疾病研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 以小型豬為動物模型開展各種耳聾模型及耳聾機(jī)制研究通過小型豬形態(tài)及內(nèi)耳研究，成功構(gòu)建了新型耳科動物模型，以此動物模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步構(gòu)建不同類型耳聾模型并進(jìn)行耳聾與眩暈的基礎(chǔ)研究。如通過噪聲暴露方法、乙基亞硝基脲（N-ethyl-N-nitrosourea，ENU）化學(xué)誘變方法和基因編輯技術(shù)構(gòu)建了小型豬噪聲性聾、Mondini畸形、單側(cè)聾、MITF基因突變、大前庭水管綜合征等一系列小型豬模型，為研究噪聲性耳聾及遺傳性耳聾發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)[25]。

2.2.1 噪音性聾應(yīng)用脈沖式火花噪聲儀對正常小型豬進(jìn)行噪聲暴露，首次成功的建立了小型豬噪聲性聾動物模型，分析噪聲性聾小型豬聽功能及內(nèi)耳形態(tài)的特點(diǎn)，填補(bǔ)了大型哺乳動物噪聲性聾動物模型的空白。在此基礎(chǔ)之上，嘗試應(yīng)用mPEG-PLGABSA-FITC-NPs納米顆粒進(jìn)行小型豬噪聲性聾動物模型的內(nèi)耳導(dǎo)入研究，為未來大型哺乳動物聽功能干預(yù)研究提供重要的研究基礎(chǔ)[26]。

2.2.2 遺傳性聾在小型豬耳科動物模型的建立與應(yīng)用過程中，科研團(tuán)隊(duì)定位、克隆出一種自發(fā)性先天性耳聾豬模型的致病基因，其臨床表現(xiàn)與人類Waardenburg綜合征2A型的特點(diǎn)類似[20]，通過研究證實(shí)其發(fā)病機(jī)制可能是由于MITF-M型基因突變,其內(nèi)耳血管紋中間細(xì)胞缺失、毛細(xì)胞缺失、蝸管發(fā)育異常、螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量減少，導(dǎo)致其耳蝸內(nèi)電位異常、聽性腦干反應(yīng)電位不能引出，為研究該病的機(jī)制和治療提供了天然的模型[27-28]，對于研究干細(xì)胞移植等耳聾治療措施的途徑和方法也具有很大的幫助[29]。另外，通過ENU化學(xué)誘變小型豬的方法獲得白色耳聾突變小型豬，并建立家系，對該家系的表型、聽力及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)等方面進(jìn)行評估，首次發(fā)現(xiàn)Mondini畸形小型豬模型及家系，為Mondini畸形的進(jìn)一步研究提供了寶貴的動物模型。小型豬動物模型將為人遺傳性聾的致病機(jī)理研究、臨床治療及藥物篩選等提供重要的生物工具[29]。

2.2.3 聽神經(jīng)病通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ouabain溶液對小型豬螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有損傷，可導(dǎo)致聽閾明顯提高，且損傷程度具有濃度依賴性，但ouabain對毛細(xì)胞的影響不明顯，此研究結(jié)果有助于通過使用ouabain溶液建立小型豬的聽神經(jīng)病動物模型。后續(xù)實(shí)驗(yàn)會進(jìn)一步研究應(yīng)用ouabain溶液時畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(distortion product otoacoustic emissions，DPOAE)、耳蝸微音器電位（cochlearmicrophonics，CM）及內(nèi)耳形態(tài)學(xué)等指標(biāo)的變化，有望成功的建立人類聽神經(jīng)病的小型豬動物模型[30]。

2.3 以小型豬為動物模型開展人工聽覺植入研究

2.3.1 人工耳蝸植入動物實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證新型人工耳蝸的必要步驟，小型豬耳蝸與人類類似，可以直接應(yīng)用人類耳蝸電極進(jìn)行植入實(shí)驗(yàn)，是非常合適的人工耳蝸實(shí)驗(yàn)動物模型[31-32]。傳統(tǒng)耳蝸動物模型包括貓、豚鼠等，產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不能完全反映人類用電極真實(shí)情況。通過用小型豬模型進(jìn)行電子耳蝸植入研究，將國產(chǎn)電子耳蝸樣機(jī)植入小型豬耳內(nèi)，檢驗(yàn)產(chǎn)品的安全性、有效性和穩(wěn)定性，為臨床患者的實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，同時初步獲得了耳聾豬的聽力恢復(fù)數(shù)據(jù)[33]，為建立人工耳蝸大型哺乳動物實(shí)驗(yàn)植入平臺奠定基礎(chǔ)。

2.3.2 聽覺腦干植入對于蝸后病變，包括螺旋神經(jīng)節(jié)、聽神經(jīng)以及聽覺中樞病變需要人工聽覺腦干植入進(jìn)行干預(yù)。經(jīng)迷路入路提供最直接的進(jìn)入耳蝸核及相關(guān)解剖的路徑[32]，其手術(shù)復(fù)雜、風(fēng)險較高，小型豬的聽覺腦干結(jié)構(gòu)類似于人類，通過在小型豬上模擬進(jìn)行ABI的過程，可以進(jìn)行手術(shù)模擬訓(xùn)練并驗(yàn)證效果，為臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

2.4 以小型豬為動物模型開展前沿治療方法探索

2.4.1 干細(xì)胞治療耳聾研究隨著干細(xì)胞技術(shù)快速發(fā)展，干細(xì)胞移植治療耳聾在小型豬動物模型中已取得一定進(jìn)展。目前存在的主要問題包括移植徑路的優(yōu)化，既可將細(xì)胞移植損傷部位又可最大程度減小內(nèi)耳損傷[34]。

目前已開展通過小型豬腰椎蛛網(wǎng)膜下腔穿刺-腦脊液途徑移植干細(xì)胞治療螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞以及聽神經(jīng)的病變。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射途徑移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以遷移至耳蝸,并對其聽性腦干反應(yīng)造成影響[35]。對于毛細(xì)胞、聽神經(jīng)都有病變的感音神經(jīng)性耳聾，干細(xì)胞移植聯(lián)合植入人工耳蝸,有望達(dá)到更好重建聽力的效果。

2.4.2 基于活體基因組編輯的基因治療技術(shù)探索

在成功建立小型豬耳聾動物模型基礎(chǔ)之上，探索基因治療的相關(guān)研究[36]，包括利用腺相關(guān)病毒(adreno-associated virus，AAV)將CRISPR/Cas9導(dǎo)入到早期MITF-/-榮昌豬的內(nèi)耳組織中，以期修復(fù)MITF基因的突變，實(shí)現(xiàn)基因治療。目前為實(shí)現(xiàn)CRIS-PR/Cas9在豬基因組中的高效、定點(diǎn)編輯，已利用豬的成纖維細(xì)胞在體外水平篩選出針對榮昌豬突變的高效切割位點(diǎn)，基因組編輯的效率可達(dá)到約50%。下一步的工作將集中于CRISPR/Cas9的導(dǎo)入時機(jī)和方式以及導(dǎo)入后表型變化的測定[36]。

隨著對豬與人類在解剖和功能方面相似性的認(rèn)識逐步加深，小型豬作為耳科新型動物模型應(yīng)用日趨成熟，開辟了耳科動物模型的全新領(lǐng)域，有可能引起耳科學(xué)基礎(chǔ)研究革命性變化。以此為基礎(chǔ)建立的各種耳聾、眩暈發(fā)病機(jī)制研究平臺、人工耳蝸植入實(shí)驗(yàn)平臺、干細(xì)胞及基因治療實(shí)驗(yàn)平臺，具有基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)向臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用轉(zhuǎn)化的價值，在聽覺及前庭基礎(chǔ)研究以及臨床耳病相關(guān)研究方面的應(yīng)用前景十分廣闊。目前由于小型豬新型耳科動物模型出現(xiàn)較晚，應(yīng)用不夠廣泛，尚需進(jìn)一步加強(qiáng)其在耳科研究中的推廣與應(yīng)用。