丙氨酰-谷氨酰胺二肽對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin定位與表達的影響

鄧宸璽 王自蕊 游金明 瞿明仁 葉亞玲 辛向榮 潘 珂

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南昌 330045)

仔豬小腸具有完整的黏膜屏障功能是保證其腸道健康的重要基礎(chǔ)，而小腸上皮細(xì)胞間良好的緊密連接結(jié)構(gòu)是維持小腸黏膜發(fā)揮正常屏障功能和吸收功能的前提。小腸上皮細(xì)胞間的這種緊密連接可封閉細(xì)胞旁間隙，使得上皮細(xì)胞僅僅對離子和氨基酸類營養(yǎng)物質(zhì)選擇性通過。研究表明，緊密連接是依靠一系列跨膜及外周蛋白相互作用形成的復(fù)合體，包括 occludin、claudin、ZO-1和JAM等多種蛋白。其中occludin最早被發(fā)現(xiàn)，是緊密連接中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，其分子質(zhì)量為64～82 ku，含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域、2個細(xì)胞外環(huán)和1個細(xì)胞內(nèi)環(huán)，可與ZO-1等蛋白結(jié)合，共同構(gòu)成緊密連接的骨架部分。occludin一旦進入緊密連接，其連接部位的膜通透性將大大降低，使大分子自由出入受阻，進而達到屏障保護作用［1］。仔豬早期斷奶后，腸道通透性增加、腸屏障功能破壞可能歸因于腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin mRNA表達量的下降［2］。在應(yīng)激狀態(tài)下，仔豬腸道幾乎完全依賴谷氨酰胺(glutamine，Gln)來支持黏膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的生理代謝以維持腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整［3］。在斷奶期間，由于無法獲得母源性Gln，仔豬容易發(fā)生Gln缺乏。因此，通過補充外源性Gln對防止仔豬斷奶應(yīng)激具有十分重要的意義。然而，目前人工合成的Gln水溶性差，易轉(zhuǎn)化為有害的焦谷氨酸和氨，且吸收率低，限制了其在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用［4］，而以丙胺酰-谷氨酰胺二肽(alanyl-glutamine dipeptide，Ala-Gln)作為Gln的供體，則可彌補Gln單體的缺陷［5］。Ala-Gln在保護仔豬腸道屏障功能方面已有一些研究，但Ala-Gln參與仔豬小腸屏障保護作用是否與小腸上皮細(xì)胞間緊密連接的形成有關(guān)?Ala-Gln是否可以上調(diào)緊密連接蛋白occludin的表達?目前鮮有報道。本試驗旨在通過體外試驗，以分離自仔豬空腸上皮的IPEC-1細(xì)胞為模型，利用免疫熒光定位和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)方法，探討Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin定位與表達的影響，以期為揭示Ala-Gln促進腸黏膜屏障功能的作用機理提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基(不含Gln)購自Hyclone公司、胎牛血清購自Gibco公司、Ala-Gln、小牛血清白蛋白(BSA)、丙烯酰胺(acrylamide)、過硫酸銨(APS)、N，N，N＇，N＇- 四 甲 基 乙 二 胺(TEMED)、三羥甲基氨基甲烷(Tris base)、甘氨酸(Gly)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)購自 Sigma公司，青霉素、鏈霉素購自北京索萊寶公司，胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)購自 Sciencell公司，鼠表皮生長因子(mEGF)、脫脂奶粉(skim milk powder)購自 BD公司，兔抗occludin C-term多克隆抗體購自Invitrogen公司，異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)購自中杉金橋公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG(H+L)、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(H+L)、鼠抗β-肌動蛋白(β-actin)單克隆抗體購自Jackson公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、甲醛、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、甲叉雙丙烯酰胺(bis-acrylamide)、吐溫-20、溴酚藍(bromphenol blue)、麗春紅S(ponceau S)、乙基苯基聚乙二醇裂解液(NP-40)、細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)購自Amresco公司，動植物膜蛋白微量制備試劑盒、2 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、5×還原樣品緩沖液、10×Tris-Gly-SDS電泳緩沖液、考馬斯亮藍、中分子質(zhì)量預(yù)染蛋白Marker(7條帶)、Stripping Buffer購自天恩澤，二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天，免疫印跡化學(xué)發(fā)光劑(ECL)、0.45 μm孔徑硝酸纖維素膜購自Millipore公司，二硫蘇糖醇(DTT)購自Merck公司，蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑購自Roche公司，甲醇、氯化鈉購自國藥集團，璜基水楊酸購自北京金匯太亞化學(xué)試劑公司，三氯乙酸購自上海研拓公司。

1.1.2 試驗培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:95%DMEM高糖培養(yǎng)基(不含Gln)+5%胎牛血清 +5 μg/L mEGF+1‰ ITS+100 U/mL青霉素+100 U/mL鏈霉素。

配制 A、B、C、D、E、F共 6種試驗培養(yǎng)基，即分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 0、0.25、0.50、1.00、2.00和4.00 mmol/L(終濃度)的Ala-Gln。

1.1.3 試驗細(xì)胞

試驗用細(xì)胞為分離自仔豬空腸上皮的成熟的IPEC-1細(xì)胞，由中科院長沙亞熱帶研究所饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 IPEC-1細(xì)胞培養(yǎng)

取傳代穩(wěn)定的同代IPEC-1細(xì)胞，同時接種于底部放有蓋玻片的分別標(biāo)記為 A、B、C、D、E、F的6塊6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，并分別加入含0、0.25、0.50、1.00、2.00 和 4.00 mmol/L(終濃度)Ala-Gln的試驗培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 occludin免疫熒光定位觀察

待細(xì)胞融合達70%以上后，吸去培養(yǎng)基，用PBS洗滌5次，每次10 min。加入中性甲醛固定液固定15 min后，用PBS洗滌。隨即加入0.5%Triton X-100處理10 min，經(jīng) PBS洗滌后，再用100 mL/L BSA封閉1 h，然后加入2 μg/mL的兔抗occludin C-term多克隆抗體，于37℃下溫育1 h。用PBS洗滌后按1∶100加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，經(jīng)37℃溫育1 h、PBS洗滌、蒸餾水沖洗后將蓋玻片取出，用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察各組樣品occludin的定位情況并拍照。

1.2.3 occludin相對表達量測定

1.2.3.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)溶液配制

30%Acr-Bis儲備液:取29 g丙烯酰胺和1 g甲叉雙丙烯酰胺，溶于100 mL雙蒸水。

1 mol/L Tris-HCl(pH 6.8):12.1 g Tris base溶于80 mL雙蒸水，用濃HCl調(diào)節(jié)pH至6.8，定容至100 mL。

1 mol/L Tris-HCl(pH 8.8):12.1 g Tris base溶于80 mL雙蒸水，用濃HCl調(diào)節(jié)pH至8.8，定容至100 mL。

10%SDS:取10 g電泳級SDS，加入90 mL雙蒸水，加熱至68℃助溶，再加入幾滴濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至7.2，用雙蒸水定容至100 mL。

10%APS:將0.1 g APS溶于1 mL雙蒸水。

TBST 緩沖液:Tris-base 2.42 g，NaCl 8.77 g，調(diào)pH至7.2～7.4，定容至1 000 mL，再加2 mL吐溫-20。

5%脫脂奶粉-TBST緩沖液:在100 mL TBST緩沖液中加入5 g脫脂奶粉。

3%BSA-TBST緩沖液:在100 mL TBST緩沖液中加入3 g BSA。

另外，按照常規(guī)方法配制5%濃縮膠和12%分離膠。

1.2.3.2 細(xì)胞膜蛋白抽提及濃度調(diào)整

將培養(yǎng)好的各組細(xì)胞用PBS沖洗1遍，加入預(yù)冷的裂解液于冰上裂解10～20 min，將細(xì)胞刮下，用EP管收集，然后經(jīng)100～200 W 超聲波破碎細(xì)胞2次，每次3 s。于4℃下12 000×g離心5 min，棄去上清，將上述操作重復(fù)3次。采用動植物膜蛋白微量制備試劑盒提取細(xì)胞膜蛋白，于-80℃保存待測。

使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒對細(xì)胞膜蛋白樣品進行定量，以RIPA將各組細(xì)胞膜蛋白樣品調(diào)成相同濃度。加入5×還原樣品緩沖液后，使樣品終濃度為0.8 mg/mL。

1.2.3.3 目的蛋白電泳及Western Blot預(yù)試驗

將樣品水浴煮沸5 min，上樣時每孔目的蛋白量為8 μg。接好電源，濃縮膠中90 V恒壓約20 min。待溴酚藍跑至分界處，將電壓調(diào)為160 V，約50 min后溴酚藍跑出分離膠，終止電泳。小心取下2塊膠，其中一塊以考馬斯亮藍染色。以記號筆在玻璃板上畫好標(biāo)記線，依線小心切去濃縮膠及兩邊未加樣泳道，并在凝膠底部最靠近左邊切去一角，以示電泳方向及加樣方向。同法操作另一塊膠。

SDS-PAGE后將目的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，條件為:300 mA恒流，0.45 μm孔徑硝酸纖維素膜，轉(zhuǎn)膜約1 h。轉(zhuǎn)膜完成后用麗春紅S染色，并觀察轉(zhuǎn)膜效果。然后將硝酸纖維素膜完全浸沒在裝有3%BSA-TBST緩沖液的封口袋中，室溫下輕搖2 h。棄封閉液，用兔抗occludin C-term多克隆抗體(3%BSA-TBST緩沖液稀釋，1∶2 000)室溫下孵育10 min，置于4℃冰箱過夜。取出硝酸纖維素膜，室溫下孵育30 min。再使用TBST緩沖液(Tris-base 20 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，pH 7.4，吐溫-20 0.05%)清洗硝酸纖維素膜5次，每次5 min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(5%脫脂奶粉-TBST緩沖液稀釋，1∶2 000)后，室溫下輕搖1 h。TBST緩沖液清洗5次，每次5 min。加入ECL 2 mL，室溫反應(yīng)3～5 min，膠片曝光30～60 s，顯影2 min，最后定影。膠片掃描后結(jié)果見圖1。

圖1 目的蛋白occludin Western Blot預(yù)試驗條帶Fig.1 Western Blot pre-experimental bands of target protein occludin

1.2.3.4 Western Blot正式試驗

SDS-PAGE后將目的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，試驗步驟與條件參照預(yù)試驗。然后用Stripping Buffer在37℃下洗膜30 min，去離子水洗膜3次，TBST緩沖液洗膜3次，每次3 min，將硝酸纖維素膜完全浸沒在3%BSA-TBST緩沖液中，室溫下?lián)u動0.5 h。將膜裝入含有鼠抗β-actin單克隆抗體(用5%脫脂奶粉-TBST緩沖液稀釋，1∶5 000)的封口袋中，室溫下孵育2 h。TBST緩沖液洗膜，共洗5次，每次5 min。再用HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(5%脫脂奶粉-TBST緩沖液稀釋，1∶10 000)室溫下孵育40 min。TBST緩沖液洗膜5次，每次5 min。加入ECL 2 mL，室溫反應(yīng)3～5 min，膠片曝光30～60 s，顯影2 min，定影。膠片掃描后結(jié)果見圖2。

1.3 統(tǒng)計分析

仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin的相對表達量以樣本與兔抗occludin C-term多克隆抗體結(jié)合后的灰度值與同一樣本與鼠抗β-actin單克隆抗體結(jié)合后的灰度值的比值表示。各組occludin相對表達量數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行方差分析，差異顯著者用LSD法進行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05為差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.01為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 目的蛋白occludin Western Blot試驗條帶Fig.2 Western Blot experimental bands of target protein occludin

2 結(jié)果與分析

2.1 Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin定位的影響

由圖3可知，對照組(A)IPEC-1細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)存在明顯的團狀陽性熒光染色(實線箭頭指示處)，而細(xì)胞間連接處缺乏陽性熒光染色(虛線箭頭指示處)。當(dāng)培養(yǎng)基中加入Ala-Gln后發(fā)現(xiàn)，IPEC-1細(xì)胞間連接處的熒光信號明顯增強，且隨著Ala-Gln濃度的升高，IPEC-1細(xì)胞輪廓更加清晰，胞質(zhì)內(nèi)熒光信號逐漸減弱，細(xì)胞間連接處的熒光信號越發(fā)增強。而細(xì)胞核的熒光信號并無肉眼可見變化。

2.2 Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin表達的影響

由表1可知，培養(yǎng)基中加入Ala-Gln后，小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin的相對表達量均較對照組極顯著升高(P＜0.01)。隨著Ala-Gln濃度的升高，occludin的相對表達量呈現(xiàn)先增后減的趨勢，在添加量為2.00 mmol/L時達到峰值，極顯著高于其他添加量(P＜0.01)。這表明，Ala-Gln可以上調(diào)仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin的表達，進而促進細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成。

圖3 仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin免疫熒光定位Fig.3 Immunofluorescence localization of tight junction protein occludin in small intestinal epithelial cells from piglets

3 討論

小腸黏膜具有屏障功能的一個重要解剖學(xué)基礎(chǔ)是小腸上皮細(xì)胞間具有完整的緊密連接。一般來說，這種緊密連接可封閉細(xì)胞旁間隙，使得腸上皮細(xì)胞僅僅對離子和氨基酸類營養(yǎng)物質(zhì)選擇性通過。但在特殊情況(如斷奶應(yīng)激)下，緊密連接往往受到破壞，細(xì)菌、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)通過腸黏膜屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)，引起機體炎癥反應(yīng)甚至多器官功能衰竭。occludin是構(gòu)成小腸上皮緊密連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，occludin一旦進入緊密連接，其連接部位的膜通透性將大大降低，使大分子自由出入受阻，進而達到屏障保護作用［6］。

表1 Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin表達的影響Table 1 Effects of Ala-Gln on the expression of tight junction protein occludin in small intestinal epithelial cells from piglets

occludin是一種跨膜蛋白，也是最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞間緊密連接蛋白［7］。occludin含有2個細(xì)胞外環(huán)，其中一個細(xì)胞外環(huán)對屏障功能有調(diào)節(jié)作用，是緊密連接的最重要結(jié)構(gòu)蛋白之一。occludin存在磷酸化和非磷酸化2種形式，磷酸化occludin為活性形式，主要集中于緊密連接纖維內(nèi)，有一小部分occludin沿著細(xì)胞側(cè)膜分布，不進入纖維內(nèi)［8］，連接相鄰的細(xì)胞，封閉細(xì)胞間的空隙［9］。而非磷酸化occludin集中在細(xì)胞質(zhì)中［10］。研究表明，Gln或其二肽通過上調(diào)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白occludin的表達而降低腸上皮的通透性被認(rèn)為是其發(fā)揮腸道屏障功能的一個可能機制。小腸黏膜對大分子物質(zhì)的通透性是評價小腸黏膜屏障功能的一項重要指標(biāo)［11］。在臨床上，要直接觀察細(xì)菌移位(bacterial translocation)比較困難，因此大多采用小腸對大分子的通透性來間接反映細(xì)菌易位的發(fā)生。據(jù)報道，Gln或其二肽可降低小腸對二乙烯三胺戊乙酸(DTPA)的通透率，其機理可能在于其可維護小腸黏膜屏障的完整性及小腸絨毛的形態(tài)，從而減少DTPA與腺凹細(xì)胞間的緊密連接及通透腸黏膜屏障的機會［12］。Gln或其二肽是目前應(yīng)用非常廣泛的腸黏膜保護劑，是維持腸道黏膜代謝、結(jié)構(gòu)和功能的必需營養(yǎng)成分，對維護腸黏膜細(xì)胞的生長、分化和增殖具有重要的意義［13-17］。體內(nèi)試驗表明，Gln缺乏可使腸道黏膜萎縮，絨毛變稀變矮，屏障功能下降，而補充Gln后能明顯增加大鼠腸黏膜質(zhì)量、恢復(fù)絨毛高度、黏膜表面積和陷窩深度，加快腸上皮細(xì)胞更新速度，阻止腸黏膜萎縮及炎癥所致的通透性增加，從而恢復(fù)并維持腸黏膜屏障功能［18-19］。Potsic 等［20］利用胃造口術(shù)研究大鼠后發(fā)現(xiàn)，Gln缺乏可引起大鼠腸上皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的破壞。崔巍等［21］在對人的結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞試驗中進一步表明，Gln缺乏會降低緊密連接蛋白occludin的相對表達量，增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性，而補充Gln能夠阻斷這些改變。近來，有人利用Caco-2細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧模型，模仿腸缺血再灌注，然后用含有不同濃度Gln的培養(yǎng)基培養(yǎng)，研究了Gln對腸黏膜的保護作用。結(jié)果證實，Gln可上調(diào)緊密連接蛋白occludin的表達［22］。根據(jù)臨床醫(yī)學(xué)的研究進展，本試驗應(yīng)用IPEC-1細(xì)胞建立體外小腸上皮細(xì)胞屏障，探討Ala-Gln對仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接相關(guān)蛋白occludin表達的影響，在對仔豬小腸上皮細(xì)胞進行免疫熒光定位后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中不含Ala-Gln時仔豬小腸上皮細(xì)胞間的連接處熒光信號微弱，而細(xì)胞質(zhì)的熒光信號較強。由此推測，對照組小腸上皮細(xì)胞中非磷酸化occludin含量較高，而起活性作用的磷酸化occludin含量較低。隨著培養(yǎng)基中Ala-Gln濃度的增加，仔豬小腸上皮細(xì)胞胞質(zhì)中的熒光信號逐漸減弱，并最終轉(zhuǎn)為陰性。與此相反的是，細(xì)胞膜緊密連接處的熒光信號則隨Ala-Gln濃度的增加而逐漸增強。此結(jié)果表明，Ala-Gln可以促進occludin的磷酸化及細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成。在occludin功能的調(diào)節(jié)中，絲/蘇氨酸的磷酸化狀態(tài)較為重要，其主要受蛋白激酶C(PKC)的影響。PKC是一類磷脂依賴性蛋白激酶，通過催化多種蛋白質(zhì)磷酸化，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、生長和分化。絲/蘇氨酸磷酸化的occludin聚集在緊密連接處，而磷酸化殘基較少的occludin則多分布在細(xì)胞質(zhì)的基底膜側(cè)［23］。而 Ala-Gln對occludin磷酸化的促進作用可能源于其對PKC活性的促進作用。試驗進一步提取了仔豬小腸上皮細(xì)胞膜蛋白，分析了其中occludin的相對表達量。結(jié)果證實，隨著Ala-Gln濃度的增大，occludin的相對表達量也逐漸增加，這與前面免疫熒光定位試驗中所觀察到的緊密連接結(jié)構(gòu)越來越明顯相吻合。由此表明，Ala-Gln可促進仔豬小腸上皮細(xì)胞膜上occludin的磷酸化，有效促進細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成，進而降低仔豬小腸黏膜的通透性，增強小腸黏膜的屏障功能。

4 結(jié)論

Ala-Gln可以上調(diào)仔豬小腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白occludin的表達，促進細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的形成，進而增強仔豬小腸黏膜的屏障功能。

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