宏基因組測序分析人參內(nèi)生細(xì)菌組成及多樣性

郭偉強(qiáng)， 錢　瑋， 胡翠英， 陳子欣， 仲匯銀， 鞠　鑫

(蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009)

人參，屬五加科植物，在我國有數(shù)千年的藥用歷史，是傳統(tǒng)名貴藥材。人參具有調(diào)氣血、安精神、止驚悸等功效。近年來，現(xiàn)代藥理擴(kuò)大人參的應(yīng)用范圍和價(jià)值，研究發(fā)現(xiàn)人參具有抗腫瘤、抗炎癥、抑菌等多種作用[1-2]。人參有效成分主要集中于人參皂苷、多糖等，如人參皂苷Rg1、Rg3、Rh2、Re等。人參皂苷Rg1通過抑制AMPK/mTOR/PI3K通路減少血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞的自噬現(xiàn)象[3]；人參皂苷Rg3下調(diào)胰島素一號增長因子的分泌，抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖[4]；人參皂苷Re在人永生化表皮細(xì)胞HaCaT中，能夠調(diào)控絲蛋白和半胱天冬 酶-14促進(jìn)皮膚的保護(hù)功能[5]；人參皂苷Rh2在結(jié)腸癌荷鼠抑制瘤模型中能夠減輕腫瘤相關(guān)抑郁癥狀[6]。

野生人參多分布于黑龍江、吉林、遼寧等地區(qū)，隨著人參種植技術(shù)的發(fā)展，栽培人參已在湖北、河南、河北等地區(qū)落戶。雖然人參的種植規(guī)模在擴(kuò)大，但依然處于供不應(yīng)求的狀況。此外，病蟲害、天氣等因素也嚴(yán)重影響人參的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。

內(nèi)生菌是一類可以在植物體內(nèi)生存的微生物，且不會(huì)對宿主植物造成任何傷害。因其次生代謝產(chǎn)物中可能含有與宿主植物相同或相似的活性成分，而成為研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[8]。因此，本試驗(yàn)以非主產(chǎn)地栽培人參為研究對象，分析其內(nèi)生細(xì)菌的組成和多樣性，以期為更好地開發(fā)利用有限的人參資源提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)材料

人參為吉林長白山野生人參(購自安徽省亳州市中藥市場)和河南省南陽市栽培人參(由河南省南陽市栽培戶饋贈(zèng))；細(xì)菌總DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；宏基因組測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

營養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基：10.0 g蛋白胨，3.0 g牛肉粉，5.0 g 氯化鈉，雙蒸水定容至1 L，pH值調(diào)至7.3。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1人參表面消毒及培養(yǎng)新鮮人參根莖經(jīng)自來水沖洗后，用50%乙醇處理15 s，75%乙醇處理30 s。隨后，將人參于1% NaClO溶液中浸泡3 min，無菌水沖洗3～5次，收集沖洗廢液。將人參根莖剪成5 mm的小段置于NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，100 r/min培養(yǎng)14 d左右。

1.2.2人參內(nèi)生細(xì)菌總DNA提取取5 mL上述培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心1 min后，在菌體沉淀中加入200 μL緩沖液GA和20 μL蛋白酶K，振蕩；加入220 μL緩沖液GB，振蕩 15 s 后70 ℃水浴10 min；加入220 μL無水乙醇，振蕩15 s，轉(zhuǎn)至吸附柱中，隨后按說明書進(jìn)行操作。使用紫外微量分光光度計(jì)檢測所提DNA的濃度和質(zhì)量。

1.2.3宏基因組測序及數(shù)據(jù)分析利用細(xì)菌16Sr DNA引物338F(5′-ACTCCTACGGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，使用Illimina PE250/PE300進(jìn)行宏基因組測序。

測序所得有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs(operational taxonomic units，簡稱OTUs)聚類分析，使用Greengene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，對OTUs進(jìn)行豐度和Alpha多樣性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　測序結(jié)果及分析

由圖1可知，隨著測序數(shù)量的增加，稀釋度曲線趨向平坦。香農(nóng)指數(shù)(圖2)說明測序數(shù)據(jù)豐富，能夠反映人參內(nèi)生細(xì)菌中的物種信息。

2.2　人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性分析

由圖3、圖4、圖5可知，在門的分類水平上，人參內(nèi)生細(xì)菌多分布在變形菌門(Proteobacteria)、硬壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)等門中，其中，野生人參內(nèi)生細(xì)菌在上述門中的含量分別約為64%、29%、7%，栽培人參內(nèi)生細(xì)菌在上述門中的含量分別約為56%、40%、4%。在綱的分類水平上，人參內(nèi)生細(xì)菌多分布于放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形菌綱(Alpha-proteobacteria)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、β-變形菌綱(Beta-proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gamma-proteobacteria)等綱中，其中，野生人參內(nèi)生細(xì)菌在上述綱中的含量分別為 7%、14%、29%、7%、43%，栽培人參內(nèi)生細(xì)菌在上述綱中的含量分別約為4%、16%、40%、8%、32%。在目的分類水平上，人參內(nèi)生細(xì)菌主要分布在芽孢桿菌目(Bacillales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、微球菌目(Micrococcales)、假單胞菌目(Pseudomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、黃單胞桿菌目(Xanthomonadales)等目中，其中，野生人參內(nèi)生細(xì)菌在上述目中的含量分別為29%、7%、14%、7%、14%、14%、14%，栽培人參內(nèi)生細(xì)菌在上述目中的含量分別為40%、8%、12%、4%、12%、16%、8%。在科的分類水平上，野生人參內(nèi)生細(xì)菌主要分布在產(chǎn)堿菌科(Alcaligenaceae)(7%)、布魯氏菌科(Brucellaceae)(7%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(14%)、微桿菌科(Microbacteriaceae)(7%)、類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)(21%)、動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)(7%)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)(14%)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)(7%)、黃單胞桿菌科(Xanthomonadaceae)(14%)等科中；栽培人參內(nèi)生細(xì)菌則多集中在產(chǎn)堿桿菌科(Alcaligenaceae)(8%)、芽孢桿菌科(Bacillaceae)(4%)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)(4%)、布魯氏菌科(Brucellaceae)(4%)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)(12%)、微桿菌科(Microbacteriaceae)(4%)、莫拉菌科(Moraxellaceae)(4%)、類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)(28%)、動(dòng)性球菌科(Planococcaceae)(8%)、假單胞桿菌科(Pseudomonadaceae)(8%)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)(4%)、未分類根瘤菌科(Rhizobiaceae-unclassified)(4%)、黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)(8%)等科中。從屬的分類水平來看，野生人參內(nèi)生細(xì)菌在無色桿菌屬(Achromobacter)(7%)、腸桿菌屬(Enterobacter)(7%)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)(7%)、微桿菌屬(Microbacterium)(7%)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)(7%)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)(21%)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(14%)、根瘤菌屬(Rhizobium)(7%)、沙雷菌屬(Serratia)(7%)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)(14.%)等屬中均有分布；栽培人參內(nèi)生細(xì)菌多集中于無色桿菌屬(4%)、不動(dòng)菌屬(Acinetobacter)(4%)、頗陌菌屬(Advenella)(4%)、芽孢桿菌屬(Bacillus)(4%)、包西氏菌屬(Bosea)(4%)、腸桿菌屬(4%)、賴氨酸芽孢桿菌屬(4%)、微桿菌屬(4%)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)(4%)、類芽孢桿菌屬(28%)、泛菌屬(4%)、假單胞菌屬(8%)、未分類根瘤菌屬(Rhizobium-unclassified)(4%)、根瘤菌屬(4%)、沙雷菌屬(4%)、寡養(yǎng)單胞菌屬(8%)、綠芽孢桿菌屬(Viridibacillus)(4%)等屬中。上述數(shù)據(jù)顯示，類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬在野生人參內(nèi)生細(xì)菌和栽培人參內(nèi)生細(xì)菌中均為優(yōu)勢種群。

3　結(jié)論與討論

本研究以河南省栽培人參為代表，利用高通量測序技術(shù)進(jìn)行16Sr RNA分析野生、栽培人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。結(jié)果顯示，在野性、栽培人參中內(nèi)生細(xì)菌均具有豐富的遺傳多樣性，野生人參內(nèi)生細(xì)菌含有類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬等10個(gè)細(xì)菌屬；栽培人參內(nèi)生細(xì)菌含有類芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬等17個(gè)細(xì)菌屬。

該研究結(jié)果可以為深入研究， 開發(fā)人參內(nèi)生細(xì)菌提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

16S rRNA具有10個(gè)保守區(qū)域和9個(gè)高變區(qū)域，其高變區(qū)域隨種屬的差異而有固定的差異序列，因此，16S rRNA在研究細(xì)菌分類和系統(tǒng)發(fā)育等方面被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)。

人參被稱為“百草之王”，藥用價(jià)值廣泛，現(xiàn)代藥理研究顯示，人參具有抗腫瘤、抗炎癥、增加免疫力等作用；但因價(jià)格、蟲害等因素阻礙了人參的應(yīng)用及推廣。近年來，隨著對內(nèi)生菌研究的深入，人參內(nèi)生菌中含有與人參功效相似的次生代謝產(chǎn)物，使人參內(nèi)生菌成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域之一[9]。田磊等從人參內(nèi)生細(xì)菌中篩選到1株具有ACC脫氫酶活性的熒光假單胞桿菌[10]；王卓等發(fā)現(xiàn)2種人參內(nèi)生真菌——GS-4和GS-22，其乙酸乙酯粗提物對人宮頸癌Hela細(xì)胞具有抑制作用，其半抑制濃度為60～140 μg/mL，這2種真菌分別為半裸鐮刀菌、半球菌[11]；姜云等研究了來源于吉林省不同區(qū)域的人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，發(fā)現(xiàn)人參內(nèi)生細(xì)菌分屬于18個(gè)種屬[12]。雖然有關(guān)人參內(nèi)生細(xì)菌的研究較多，但關(guān)于野生、栽培人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其之間的差異性等研究較少。作為人參內(nèi)生細(xì)菌的差異性研究，本研究屬于首次。

本研究分析栽培人參與野生人參細(xì)菌多樣性的差異主要為，栽培人參細(xì)菌的豐度略高于野生人參細(xì)菌的豐度，栽培人參含有17個(gè)細(xì)菌種屬，其中類芽孢桿菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬等為優(yōu)勢屬。這為人參內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)和應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)，也為研究不同產(chǎn)地人參內(nèi)生細(xì)菌的多樣性提供參考依據(jù)和試驗(yàn)技術(shù)，對推廣人參栽培具有積極意義。

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