對元腎顆粒長期毒性試驗的研究

王瓊仙　劉佳　王利梅　趙遠(yuǎn)　王毅

[摘要]本研究觀察了元腎顆粒連續(xù)灌胃3個月對大鼠的體重、血液學(xué)指標(biāo)、尿常規(guī)、血清生物化學(xué)指標(biāo)以及主要臟器指數(shù)和病理組織學(xué)的影響。結(jié)果表明：元腎顆粒大劑量（1292g生藥/kg）、中劑量（748g生藥/kg）、小劑量（432g生藥/kg），所用劑量分別相當(dāng)于臨床擬用劑量（126g生藥/日）的718倍、416倍和24倍，連續(xù)灌胃3個月和停藥3周后未發(fā)現(xiàn)明顯的毒性反應(yīng)。雄性大劑量組從第3周起、中劑量組從第11周起、雌性大劑量組從第13周起，給藥大鼠體重與對照大鼠體重相比即有顯著差異；恢復(fù)期內(nèi)，給藥組大鼠體重增長明顯。

[關(guān)鍵詞]元腎顆粒；毒性實驗；研究

[DOI]1013939/jcnkizgsc201547121

1試驗?zāi)康?/p>

觀察大鼠連續(xù)灌胃給予元腎顆粒3個月所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及程度，以評價其臨床用藥的安全性。

2試驗材料

（1）受試制劑：元腎浸膏，每1g相當(dāng)于646g生藥，成人日劑量195g（相當(dāng)于126g生藥），昆明禾潤藥物開發(fā)有限公司提供，批號：030226。

（2）動物：SD大鼠，雌雄各半；雄性平均體重為10330±739g，雌性平均體重為9962±816g。由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供，合格證號：SCXK（滇）2011-0004。

（3）儀器：ALCYON 300全自動生化分析儀，美國雅培公司生產(chǎn)。CL4型半自動止凝血測定儀，德國BE公司產(chǎn)品。BP310S電子天平，北京賽多利斯天平有限公司生產(chǎn)。

（4）實驗環(huán)境：云南省中醫(yī)中藥研究院動物實驗屏障系統(tǒng)，SPF級，合格證號：滇實動證第2003002號。

3試驗方法

31分組給藥

大鼠隨機(jī)分為4組：對照組元腎顆粒大、中、小劑量組。每組20只，雌雄各半。大劑量組給予1292g生藥/kg的元腎浸膏，該劑量為最高可灌胃劑量，相當(dāng)于人臨床擬用劑量的718倍；中劑量組給予748g生藥/kg的元腎浸膏，相當(dāng)于人臨床用量的416倍；小劑量組給予432g生藥/kg的元腎浸膏，相當(dāng)于人臨床用量的24倍。大鼠適應(yīng)試驗環(huán)境一周后開始灌胃給藥，每天2次，連續(xù)3個月，給藥容量均為20ml/kg體重，每周按體重調(diào)整灌胃體積。給藥3個月后，每組殺檢14只（雌、雄各7只），進(jìn)行各項指標(biāo)檢測，觀察有無毒性反應(yīng)。剩余大鼠停止給藥3周后殺檢，以觀察有無繼發(fā)性不良反應(yīng)。

32觀察指標(biāo)

（1）一般狀態(tài)：給藥期間每日觀察大鼠精神、行為、活動、排便等情況。給藥期間及恢復(fù)期每日檢測各只動物進(jìn)食、進(jìn)水量。

（2）體重：給藥期間和恢復(fù)期每周稱體重一次。

（3）血液學(xué)檢查：大鼠給藥期限結(jié)束后，放血處死，取血以止凝血測定儀測定血漿凝血酶原時間（PT）、凝血酶時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（PTT），血球計數(shù)儀測定白細(xì)胞總數(shù)（WBC、）和分類（淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)LY、單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)M0、中性粒細(xì)胞百分?jǐn)?shù)NE）、紅細(xì)胞總數(shù)（RBC）、網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)（RC）、血紅蛋白含量（Hgb）、血小板計數(shù)（PLT）、紅細(xì)胞比積（HCT）、紅細(xì)胞平均體積（MCV）、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量（MCH）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、血小板比積（PCT）、血小板分布寬度（FDW）。

（4）血清生物化學(xué)檢查：上述大鼠取血樣，離心分離血清，用全自動生化分析儀檢測乳酸脫氫酶（LDH）、a一羥丁酸脫氫酶（HBDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、肌酐（CR）、尿素氮（BUN）、血糖（GLU）、總膽紅素（TBIL）、甘油三酯（TG）、總蛋白（TP）、球蛋白（GLB）、尿酸（UA）共計十三項。

（5）尸體解剖和臟器指數(shù)：各組大鼠放血處死后，立即進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察各臟器有無病理改變，取出心、肝、脾、等16個臟器，剝離后分別稱重，并計算臟器指數(shù)（g/100g）。

（6）病理組織學(xué)檢查：將上述臟器放入10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木素、伊紅染色，再經(jīng)脫水、透明、封固后光鏡下觀察；先對大劑量組、對照組大鼠的臟器進(jìn)行檢查，如果大劑量組發(fā)現(xiàn)異常，再對中、小劑量組臟器進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

（7）統(tǒng)計學(xué)處理：比較組間差異采用t檢驗。

4試驗結(jié)果

（1）一般狀態(tài)：三個給藥組大鼠在給藥期間，雄性大劑量組從給藥第1周起、中劑量組從給藥第9周起，進(jìn)食量顯著低于對照組；雌性大劑量組從給藥第8周起、中劑量組從給藥第10周起，進(jìn)食量顯著低于對照組，恢復(fù)期各給藥組大鼠的進(jìn)食量與對照組無顯著差異。給藥組大鼠的飲水量僅雄鼠的個別周次與對照組有差異。未見行為活動、排便、分泌等方面的毒性反應(yīng)，各組動物無死亡。

（2）體重：給藥期內(nèi)，雄性大劑量組從第3周起、中劑量組從第11周起，雌性大劑量組從第13周起，給藥大鼠體重與對照大鼠體重相比即有顯著差異；恢復(fù)期內(nèi)，給藥組大鼠體重增長明顯。

（3）血清生物化學(xué)檢查：給藥3個月后，大劑量組的LDH、ALT、GLu、CHOLTG，中劑量組的HBDH、ALT、AST、IBIL、TG、UA，小劑量組的HBDH、ALT、TBIL、DBIL，與對照組比較有顯著性差異；恢復(fù)期后各給藥組對照組比較無顯著差異。

（4）血液學(xué)檢查：給藥3個月后，中、小劑量組的TT、RDW、MPV、PDW與對照組比較有顯著差異，其他血液學(xué)指標(biāo)各組間無顯著差異；恢復(fù)期后，大、中劑量組的PTT與對照組比較有顯著差異，其他血液學(xué)指標(biāo)各組間無顯著差異。

（5）尿常規(guī)檢驗：給藥3個月及恢復(fù)期后，各組大鼠的尿常規(guī)檢驗未見顯著差異。

（6）主要臟器檢查：元腎顆粒給藥組與對照組大鼠在給藥3個月及恢復(fù)期結(jié)束后均進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察主要臟器未見明顯異常。給藥3個月，大劑量組與中劑量組的心臟系數(shù)、肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)、腦系數(shù)、胃系數(shù)、腎上腺系數(shù)、睪丸系數(shù)，均高于對照組?；謴?fù)期結(jié)束后各給藥組臟器指數(shù)與對照組比較無顯著差異。

（7）病理組織學(xué)檢查：給藥3個月，大劑量組與對照組比較無顯著差異。

5結(jié)論

本試驗根據(jù)《中藥新藥研究的技術(shù)要求》《中藥新藥研究指南》和《新藥臨床前安全性評價與實踐》的要求，根據(jù)元腎顆粒的臨床用量、療程，確定大劑量和為人臨床擬用劑量的倍數(shù)。連續(xù)給藥三個月，按要求觀察了各項指標(biāo)。結(jié)果顯示：元腎顆粒連續(xù)灌胃給藥三個月對大鼠進(jìn)食量、體重增長及心、肝、腎、胃、腦、睪丸、附睪、腎上腺的臟器系數(shù)有一定的影響，原因可能系給藥濃度、劑量過大，導(dǎo)致動物攝食減少、體重增長緩慢。大劑量比中、小劑量影響顯著，并且停藥后逐漸恢復(fù)正常，表明其不良反應(yīng)是可逆的；血液學(xué)及血清生物化學(xué)的某些指標(biāo)顯示給藥組與對照組有差異，提示臨床試驗時應(yīng)關(guān)注患者的消化系統(tǒng)功能及血液學(xué)檢查。大劑量組的病理組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)。綜上所述，元腎顆粒在受試劑量經(jīng)口給藥3個月，對大鼠無明顯毒性作用。