葡萄汁中抗腫瘤成分反式白藜蘆醇含量的測(cè)定及其影響因素

趙光　李珺　陳超陽(yáng)

【摘 要】 目的：利用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葡萄汁中抗癌成分反式白藜蘆醇的含量，并研究其環(huán)境影響因素。方法：選取ZORBAX-C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相：70%水-30%乙腈；波長(zhǎng)：306nm；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：20μl，葡萄汁經(jīng)濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣測(cè)定其中的反式白藜蘆醇含量；并采用相同方法研究光照、溫度及密封狀況對(duì)其含量的影響。結(jié)果：淳果籃濃縮紫葡萄汁中反式白藜蘆醇的含量為（1.64±0.07mg/l），匯源百分百的含量為（0.25±0.01mg/l），統(tǒng)一葡萄多中未檢測(cè)到反式白藜蘆醇。另外，陽(yáng)光照射、升高溫度、密封狀況差都會(huì)導(dǎo)致反式白藜蘆醇含量下降。結(jié)論：不同品牌的葡萄汁中反式白藜蘆醇含量相差較大；低溫避光密封條件下可減少葡萄汁中反式白藜蘆醇的損失。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法；葡萄汁；反式白藜蘆醇

【中圖分類號(hào)】R155.5+9 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2015）09-0019-03

Abstract：Objective To determine the content of trans-resveratrol，an anti-cancer active ingredient in grape juice，and to analyze the environmental influence factors of its content by high-performance liquid chromatography（HPLC）.Methods All samples were determined by ZORBAX-C18 column（250mm×4.6mm，5μm） at UV 306nm wavelength，using 70% water-30% acetonitrile as the mobile phase.The determination of grape juice was carried out by direct injection.After the determination，the same chromatographic conditions and methods were used to study the influence of light，temperature and sealed condition on the content of trans-resveratrol.Results The concentrations of trans-resveratrol in Huiyuan grape juice and Chunguolan purple grape juice were （1.64±0.07mg/L） and （0.25±0.01mg/L），respectively.No trans-resveratrol was found in Tongyi grape juice.The results show that，sunlight， high temperature and poor seal condition decreased the content of trans-resveratrol.Conclusion The content of trans-resveratrol varies in different brands of grape juice.The grape juice should be stored in cool，dark and sealed conditions to maintain the content of trans-resveratrol.

Keywords：HPLC；Grape juice；trans-Resveratrol

葡萄果實(shí)柔軟、酸甜可口。隨著生活水平提高，葡萄的消費(fèi)需求提高，并且加工后的產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，如葡萄酒、葡萄果汁等相關(guān)食品增多[1]。如何監(jiān)測(cè)并提高產(chǎn)品的品質(zhì)，增強(qiáng)其保健功能逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄含有豐富的多羥基酚類化合物——白藜蘆醇，其在葡萄的果肉、果皮、種子、葉片、葉梗、穗軸等不同組織中均有分布[2]。葡萄飲品對(duì)人體有一定的保健效果，如：白藜蘆醇成分對(duì)人體的代謝機(jī)能、細(xì)胞活性有調(diào)節(jié)作用[3-4]。

白藜蘆醇（Resveratrol，簡(jiǎn)稱Res）化學(xué)名稱為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯（ 3，4'，5-trihydroxystilbene），又稱芪三酚，是芪類物質(zhì)單體中最重要的活性物質(zhì)。白藜蘆醇為無(wú)色針狀結(jié)晶，難溶于水，易溶于乙醚、甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑，熔點(diǎn)為256～258 ℃，升華溫度為261 ℃[5]。遇堿性溶液氨水顯紅色，與三氯化鐵-氰化鉀發(fā)生顯色反應(yīng)可用來(lái)鑒定白藜蘆醇。自然界中有順、反兩種結(jié)構(gòu)，主要以反式構(gòu)象存在，且反式異構(gòu)體的生物活性強(qiáng)于順式。白藜蘆醇的生物活性多樣，具有抗氧化[6]、抗自由基、抗腫瘤[7- 8]、抗炎、保護(hù)心血管、保護(hù)肝細(xì)胞[9]、抗肥胖[10]的功效。白藜蘆醇的來(lái)源比較廣泛，藜蘆、虎杖、葡萄、花生、鳳梨等天然植物中均含有白藜蘆醇及其糖苷，白藜蘆醇糖苷在腸道糖苷酶作用下可釋放白藜蘆醇，其中葡萄中白藜蘆醇含量較高[11]。近年研究人員通過(guò)人工途徑來(lái)合成白藜蘆醇類似物[12]。

隨著人們對(duì)白藜蘆醇的保健功效和藥效的關(guān)注，對(duì)白藜蘆醇的研究也日漸增多，包括白藜蘆醇類化合物的提取、結(jié)構(gòu)和活性[13]。由于天然植物來(lái)源的抗腫瘤物質(zhì)更安全[14]，含白藜蘆醇的葡萄飲品倍受關(guān)注。目前，大多數(shù)研究集中在提取、分離、分析測(cè)定方法的改進(jìn)上，包括三維熒光光譜法[15]、電噴霧多級(jí)質(zhì)譜[16]、HPLC 法[17]。高效液相色譜法比較經(jīng)典、可靠，用于檢測(cè)白藜蘆醇含量具有普適性，并且結(jié)合抗腫瘤等活性作用分析的較少，本文通過(guò)對(duì)白藜蘆醇含量進(jìn)行檢測(cè)，分析其環(huán)境影響因素，作為產(chǎn)品保存和質(zhì)量監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的應(yīng)用前景。在之前的工作中研究了葡萄酒中白藜蘆醇的含量[18]，本文就葡萄果汁中白藜蘆醇含量的HPLC檢測(cè)方法及其環(huán)境因素的影響進(jìn)行進(jìn)一步的探討。

1 材料及方法

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀；ZORBAX SB-C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；50μl進(jìn)樣針（上海飛鴿公司）；0.45μm水系、有機(jī)系針式過(guò)濾器（天津津騰公司），Heidolph旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；EYELA CCA-1111冷阱。

1.2 材料 反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（江蘇南京澤朗生物科技有限公司），統(tǒng)一葡萄多，匯源百分百葡萄汁（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：Q/MAA D001S），淳果籃紫葡萄汁；甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

1.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：70%水-30%乙腈；流速：1ml/min；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：306nm。

1.4 陽(yáng)光照射對(duì)白藜蘆醇含量的影響 將葡萄汁供試品分別分為A、B兩份， A份密封避光保存，B份密封于自然光源下保存。保持其它因素相同，葡萄汁樣品于0、2、4h后直接測(cè)定反式白藜蘆醇含量。以A份樣品為對(duì)照，研究光照對(duì)B份樣品中反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

1.5 貯藏溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 將葡萄汁分別平均分為A、B、C三組，模擬日常的貯藏條件，將其分別避光密封貯藏于4、20、40℃環(huán)境中。恒溫6h后，分別測(cè)定各組中反式白藜蘆醇的含量，研究貯藏溫度對(duì)反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

1.6 密封狀況對(duì)白藜蘆醇含量的影響 將葡萄汁平均分為A、B兩組，A組避光密封于陰涼處儲(chǔ)存，B組避光開蓋于陰涼處儲(chǔ)存，保持其它條件相同，分別在24h、48h、72h后測(cè)定反式白藜蘆醇的含量，研究密封狀況對(duì)反式白藜蘆醇的含量是否有影響。

1.7 樣品測(cè)定 取三種市售葡萄汁（統(tǒng)一葡萄多、匯源百分百葡萄汁、淳果籃濃縮紫葡萄汁）分別進(jìn)樣20μl，重復(fù)測(cè)定3次，求峰面積的平均值，通過(guò)回歸方程計(jì)算出反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度。

1.8 數(shù)據(jù)處理 用Origin Pro8軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并得到回歸方程；用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性分析 在選定的色譜條件下，測(cè)得反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖（見圖1），標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為8min；測(cè)得樣品的色譜圖（見圖2）。

2.2 線性關(guān)系 精密稱取反式白藜蘆醇標(biāo)樣5.00mg，用乙腈溶解并定容至50ml，配成濃度為100.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1ml該溶液定容至100ml，配制成濃度為1.00mg/L的溶液，后逐級(jí)稀釋成濃度分別為5.00×10-1、2.50×10-1、1.25×10-1、6.25×10-2、3.12×10-2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個(gè)濃度進(jìn)樣20μl，在上述色譜條件下分析，以峰面積Y對(duì)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度X（mg/L）進(jìn)行線性回歸，得線性方程為： Y=126.25175X+1.20303（R2=0.99903）。在0.0312～1.00mg/L線性關(guān)系良好。

2.3 精密度試驗(yàn) 在上述色譜條件下，精密吸取1.00mg/L對(duì)照品溶液20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，求得對(duì)應(yīng)的反式白藜蘆醇含量，得精密度RSD為1.90%，說(shuō)明反式白藜蘆醇較為穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批匯源百分百葡萄汁供試品溶液共5份，進(jìn)樣測(cè)定。求得對(duì)應(yīng)的反式白藜蘆醇含量，計(jì)算其含量的RSD值為1.16%，說(shuō)明反式白藜蘆醇在葡萄汁樣品中較為穩(wěn)定。

2.5 樣品含量測(cè)定 測(cè)得統(tǒng)一葡萄多、匯源百分百果汁、淳果籃濃縮紫葡萄汁中反式白藜蘆醇的峰面積與對(duì)應(yīng)的反式白藜蘆醇質(zhì)量濃度見表1。

2.6 陽(yáng)光照射對(duì)白藜蘆醇含量的影響 A、B兩組匯源百分百果汁供試品分別貯藏0、2、4h后峰面積與含量的變化情況見表2。

2.7 貯藏溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 6h后A、B、C三組葡萄汁中反式白藜蘆醇的峰面積及所對(duì)應(yīng)的含量見表3。

2.8 密封狀況對(duì)白藜蘆醇含量的影響 A、B兩組葡萄汁樣品放置24、48、72h后的峰面積與對(duì)應(yīng)的含量見表4。

3 討論

在確定色譜條件時(shí)，考慮到的乙腈含量高的流動(dòng)相使反式白藜蘆醇的出峰時(shí)間過(guò)早，故加大水的比例至70%使其在8min左右出峰。葡萄汁的精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)所得RSD值均小于2.00%，符合要求，說(shuō)明儀器的精密度及方法的重復(fù)性良好。

對(duì)葡萄汁樣品進(jìn)行反式白藜蘆醇的含量測(cè)定，可知不同品牌的葡萄汁中反式白藜蘆醇的含量有較大差異。統(tǒng)一葡萄多中未檢出反式白藜蘆醇，匯源百分百果汁中反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度較低，而淳果籃紫葡萄汁中反式白藜蘆醇的質(zhì)量濃度較高。

在光照對(duì)反式白藜蘆醇含量的影響的研究中，貯存2、4h后，葡萄汁樣品中反式白藜蘆醇的含量顯著降低。由于兩組樣品最初的反式白藜蘆醇含量相同，除光照外其他貯藏條件亦相同，故可推斷反式白藜蘆醇含量的降低是光照所致。故葡萄飲品應(yīng)注意避光保存。

在溫度對(duì)反式白藜蘆醇含量的影響的研究中，6h后葡萄汁樣品中反式白藜蘆醇的含量也呈遞減趨勢(shì)。由于樣品中最初的反式白藜蘆醇含量相等，且除貯藏溫度外其他貯藏條件亦相同，故可推斷其含量差異是由貯藏溫度所導(dǎo)致，即反式白藜蘆醇的含量隨溫度升高而下降。

在密封狀況對(duì)反式白藜蘆醇含量的影響的研究中，24h、48h、72h后不密封葡萄汁樣品中反式白藜蘆醇的含量也均降低。由于樣品中最初的反式白藜蘆醇含量相同，且除密封狀況外其他貯藏條件均相同，故可推知密封狀況對(duì)反式白藜蘆醇的含量有影響，密封條件差可導(dǎo)致反式白藜蘆醇含量下降。

實(shí)驗(yàn)證明不同品牌的葡萄汁中反式白藜蘆醇含量相差較大，陽(yáng)光照射、升高溫度及密封狀況差都會(huì)引起葡萄飲品中反式白藜蘆醇含量的下降，低溫、避光且密封的條件下可減少葡萄汁中反式白藜蘆醇的損失。

參考文獻(xiàn)

[1]汪開拓，馬莉，盧霞.超聲波輔助提取葡萄皮渣中白藜蘆醇工藝的優(yōu)化研究[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，26（3）：1201-1206.

[2]李曉東，何卿，鄭先波，等.葡萄白藜蘆醇研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)，2011，38（1）：171-184.

[3]Rotches-Ribalta M，Andres-Lacueva C，Estruch R，et al.Pharmacokinetics of resveratrol metabolic profile in healthy humans after moderate consumption of red wine and grape extract tablets[J].Pharmacological Research，2012，66（5）：375-382.

[4]Tome-Carneiro J，Larrosa M，Yanez-Gascon M J，et al.One-year supplementation with a grape extract containing resveratrol modulates inflammatory-related microRNAs and cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of type 2 diabetes and hypertensive patients with coronary artery disease[J].Pharmacological Research，2013，72：69-82.

[5]李潔，熊興耀，曾建國(guó)，等.白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15 （2）：100-108.

[6]歐陽(yáng)夢(mèng)云，王燕.白藜蘆醇的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工學(xué)刊（中），2013，21（6）：53-54.

[7]顧煜琛.白藜蘆醇對(duì)黑色素瘤細(xì)胞黏附生物學(xué)行為的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（1）：92-94.

[8]郭慧琳，張獻(xiàn)全.白藜蘆醇與乳腺癌相關(guān)研究進(jìn)展[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（6）：703-704，718.

[9]陸瑤，黃志軍，袁洪.白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性影響的研究進(jìn)展[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（5）：653-656.

[10]Wang B，Sun J，Li X，et al.Resveratrol prevents suppression of regulatory T-cell production，oxidative stress，and inflammation of mice prone or resistant to high-fat diet–induced obesity[J].Nutrition Research，2013，33（11）：971-981.

[11]趙克森.白藜蘆醇的生物學(xué)特性和效應(yīng)[J].中國(guó)病理生理雜志，2012，28（9）：1709-1711.

[12]Mazzone G，Malaj N，Russo N，et al.Density functional study of the antioxidant activity of some recently synthesized resveratrol analogues[J].Food Chemistry，2013，141（3）：2017-2024.

[13]王添，都鎮(zhèn)先，張海燕，等.白藜蘆醇增加脂肪細(xì)胞3T3-L1中脂聯(lián)素表達(dá)的作用機(jī)制探討[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，42（1）：56-59，64.

[14]趙光，李珺，元華龍，等.天然產(chǎn)物中脂肪酸合酶抑制劑的篩選[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2009，18（20）：2-3.

[15]劉佳欣，文震，涂志紅，等.三維熒光光譜法測(cè)定紅酒中白藜蘆醇的含量[J].食品工業(yè)科技，2013，12（2）：72-74.

[16]劉一，李媛，趙立波，等.4種白藜蘆醇類化合物的電噴霧多級(jí)質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J].中國(guó)藥房，2013，24（1）：33-36.

[17]張志剛，于林怡，孫哲，等.葡萄皮渣中有效藥物成分白藜蘆醇的提取與檢測(cè)[J].臨床合理用藥雜志，2013，6（3）：177-178.

[18]趙光，李珺，陳超陽(yáng).葡萄酒中抗癌活性成分反式白藜蘆醇含量及其環(huán)境因素的影響[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2014，11（3）：4-7.

（收稿日期：2015.02.04）