miRNA在骨科疾病中的研究進(jìn)展

杜勇軍等

【關(guān)鍵詞】 微小RNA；骨肉瘤；骨性關(guān)節(jié)炎；骨質(zhì)疏松癥；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎

中圖分類號：R68 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.05.025

miRNA是近些年來研究的一大熱題。它是在進(jìn)化上具有高保守性的非編碼蛋白序列，多在真核生物及病毒中被發(fā)現(xiàn)。其主要是通過與靶向信使RNA特異性結(jié)合，產(chǎn)生譯翻譯抑制和RNA降解。它參與生物體內(nèi)多種調(diào)控途徑且與多種疾病的發(fā)生機(jī)制有著密切的聯(lián)系，如腫瘤的發(fā)生、感染性疾病、自身免疫性疾病及心腦血管疾病等。miRNA的發(fā)現(xiàn)對分子生物學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展有重要意義，并對多種疾病的基因靶向治療提供了新的方向。本文以miRNA的生物學(xué)特性為基礎(chǔ)，結(jié)合其在骨科疾病中的發(fā)生、發(fā)展中的研究進(jìn)展展開綜述。

1 miRNA的一般概述

1.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)及合成

miRNA最早發(fā)現(xiàn)于1993年，Lee等人在秀麗絲蟲中發(fā)現(xiàn)了miRNA家族中的第一個成員Lin4，開始并未吸引人們的目光，直到2000年，Reinhart等[1]在絲蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了另一個成員miRNAlet7，并提出其調(diào)控基因表達(dá)的作用可能是多種生物中所共存的機(jī)制這一學(xué)說。由此，miRNA的出現(xiàn)給學(xué)術(shù)界帶來了又一大研究課題，不斷有關(guān)于miRNA的發(fā)現(xiàn)、學(xué)說等浮現(xiàn)在人們眼前，最終科學(xué)家們在線蟲、果蠅、哺乳動物、病毒等中發(fā)現(xiàn)了大量的此類RNA，并統(tǒng)一命名為miRNA。miRNA的合成是一個比較復(fù)雜的過程，其中需要多種酶的參與[2]。首先是在細(xì)胞核內(nèi)，編碼miRNA信息的基因通過RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄成具有特殊發(fā)夾結(jié)構(gòu)的primiRNA；其次在Drosha酶的微切割下形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNA前體，稱為：premiRNA，長度60～70 nt，最終premiRNA轉(zhuǎn)移到胞漿后在Dicer酶的作用下形成一個5端磷酸化、3端有2個游離核苷酸的不完全互補(bǔ)且不穩(wěn)定的雙鏈RNA分子，并迅速降解成為長度為21～25 nt的單鏈非編碼的miRNA；最后由最終產(chǎn)物與靶基因結(jié)合來發(fā)揮基因調(diào)控作用。

1.2 miRNA的作用機(jī)制及檢測技術(shù)

miRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的非編碼蛋白、短序列且高保守的小分子RNA。成熟的miRNA通過與靶向mRNA的3非翻譯區(qū)域結(jié)合來實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控。根據(jù)其結(jié)合匹配程度不同可分為兩種作用機(jī)制。一類是與靶向RNA完全或者近似完全配對，而發(fā)揮與siRNA類似的作用，引起靶mRNA的降解，從而抑制其翻譯；另外一類是與靶向RNA不完全的互補(bǔ)配對時，miRNA主要通過抑制靶RNA翻譯時的啟動和延長階段達(dá)到抑制翻譯的作用。隨著人類發(fā)現(xiàn)miRNA的重要功能后，其檢測技術(shù)也有了突飛猛進(jìn)的進(jìn)步，如印跡技術(shù)、陣列雜交技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄PCR（RTPCR）技術(shù)、電化學(xué)檢測技術(shù)等[3]。其中最早使用的是印跡雜交技術(shù)（即nothern blotting），后來Chen等[4]將RTPCR技術(shù)引入到miRNA檢測中，并可以實(shí)時定量，后續(xù)該技術(shù)逐漸發(fā)展成人們檢測miRNA的最常用技術(shù)。

2 miRNA與骨科疾病的相關(guān)性

2.1 miRNA在骨肉瘤中的表達(dá)

骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是指成骨間葉細(xì)胞所產(chǎn)生的原發(fā)惡性骨或軟組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率在原發(fā)性惡性腫瘤中占據(jù)首位，以成骨或骨樣組織的梭形基質(zhì)細(xì)胞為特征。多發(fā)于青少年，且男性多于女性，主要好發(fā)于干骺端，其中以股骨下段及脛骨上段多見，且可發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，治療起來比較棘手。早期治療的預(yù)后較差，手術(shù)后5年存活率僅為5%～20%，而隨著新型輔助化療的出現(xiàn)，其5年存活率提升至60%～70%。但一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移治療起來相當(dāng)困難，且預(yù)后非常不理想。故對OS的發(fā)病機(jī)制、治療方案等研究仍需不斷拓展。隨著miRNA的出現(xiàn)，不少學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA在OS的發(fā)病及病情發(fā)展中有著密切的聯(lián)系，這為OS的臨床研究開辟了新的道路。

早在2009年就有文獻(xiàn)報道[5]miRNA1及miRNA206基因的表達(dá)可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞分化并能抑制橫紋肌肉瘤的生長。而miRNA1可以抑制甲硫氨酸（MET）的表達(dá)，MET具有酪氨酸激酶活性，在多種癌癥中均有表達(dá)并與調(diào)節(jié)蛋白有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤的腫瘤細(xì)胞中miRNA1有著差異表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[6]，miRNA21在骨肉瘤中的表達(dá)明顯高于正常骨組織，其對骨肉瘤的診斷及判斷預(yù)后有著重要的作用，研究同時發(fā)現(xiàn)miRNA21的表達(dá)與RECK蛋白有一定的相關(guān)性。miRNA21可能主要通過調(diào)控RECK蛋白的表達(dá)來調(diào)節(jié)骨肉瘤的入侵和轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)[7]，骨肉瘤病變組織中的miRNA34明顯低表達(dá)，其主要通過與CDK6、E2F3、E2、Bcl2等靶點(diǎn)結(jié)合，從而抑制P53介導(dǎo)的G1抑制和凋亡。P53是一種抑癌基因，編碼分子量為53 KDa的蛋白質(zhì)，并由此得名，其可分為野生型和突變型，P53對細(xì)胞周期的調(diào)控主要通過下游基因WAF1實(shí)現(xiàn)，突變型P53不能激活其下游基因而產(chǎn)生P21WAF1，導(dǎo)致細(xì)胞周期停止在G1期，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展，而野生型P53的作用正好與突變型相反。Lulla等[8]在骨肉瘤細(xì)胞中通過RTPCR發(fā)現(xiàn)了22種與正常骨組織細(xì)胞相比異常表達(dá)的miRNA，其中高表達(dá)的有四種：miRNA135b、miRNA150、miRNA5425p和miRNA652，而miRNA135b、miRNA150早已被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。Won等[9]在骨肉瘤的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)有10種miRNA的表達(dá)明顯高于正常人，其中發(fā)現(xiàn)notch信號通道中的miRNA199b5p與OS的發(fā)病密切相關(guān)，并表示miRNA199b5p抑制劑可能會用于骨肉瘤的治療。隨著科技的進(jìn)步，越來越多與OS相關(guān)的miRNA逐漸浮出水面，這無疑為其治療提供了新的研究方向。

2.2 miRNA在骨性關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是關(guān)節(jié)外科較常見的老年性疾病，主要以關(guān)節(jié)軟骨的平衡遭受破壞所致的慢性、漸進(jìn)性的退行性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹?，故又稱退行性關(guān)節(jié)炎。OA的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今發(fā)現(xiàn)的主要發(fā)病因素有：遺傳、年齡、體重、外傷、關(guān)節(jié)炎癥、細(xì)胞因子等。諸多發(fā)病因素中，歸根結(jié)底還是關(guān)節(jié)軟骨的異常發(fā)育。而有報道顯示miRNA在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的發(fā)育與修復(fù)過程中有一定的表達(dá)規(guī)律，這無疑給骨性關(guān)節(jié)炎的研究者提供了另一廣闊的探索空間。Miyaki等[10]通過基因敲除的方法建立miRNA140基因缺失的小鼠模型，誘導(dǎo)出了小鼠關(guān)節(jié)軟骨呈現(xiàn)原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎的改變，相反利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)使小鼠表達(dá)miRNA140，發(fā)現(xiàn)這些小鼠有抵抗抗原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎的能力。同時他們也發(fā)現(xiàn)了miRNA140基因敲除的小鼠軟骨內(nèi)成骨障礙，從而導(dǎo)致小鼠四肢短小及骨骼畸形等改變。有研究發(fā)現(xiàn)miRNA146α和miRNA22的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶13的表達(dá)有一定聯(lián)系，但具體表達(dá)水平尚不清楚，可見它們的表達(dá)與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展也密不可分。隨著研究的深入，miRNA140在骨性關(guān)節(jié)炎中的基因調(diào)控作用也逐步得到闡述。后續(xù)的研究[11]還發(fā)現(xiàn)，miRNA140基因的表達(dá)與聚蛋白多糖酶5（ADAMTS5）及金屬基質(zhì)蛋白酶13（MMP13）的表達(dá)水平有著直接的聯(lián)系，且miRNA140基因表達(dá)減少時ADAMTS5及MMP13基因表達(dá)明顯增高。而其他的研究也表明[12]，ADAMTS5及MMP13在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的高表達(dá)是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的兩種重要的水解酶。可見miRNA140基因的表達(dá)高低直接影響著軟骨的生長與破壞水平。而另有研究發(fā)現(xiàn)[13]，在miRNA140基因敲除的小鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了miRNA140可抑制BMP信號通路，從而保持軟骨細(xì)胞分化，這一現(xiàn)象與Dnpep的過度有關(guān)，而miRNA140基因缺失的小鼠Dnpep高表達(dá)導(dǎo)致BMP信號降低而使關(guān)節(jié)軟骨被破壞。

2.3 miRNA在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的表達(dá)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種全身性自身免疫性疾病，多為慢性起病，主要特征是關(guān)節(jié)滑膜的炎癥。RA以侵犯多關(guān)節(jié)為主，呈多發(fā)性和對稱性。主要病理特征是關(guān)節(jié)滑膜增厚合并大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管翳形成及軟骨組織的侵蝕與破壞[14]。隨著RA的發(fā)展最終將導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直畸形、功能障礙，甚至殘廢。RA屬于一種自身免疫性疾病，影響其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的因素較多。而近年大量研究發(fā)現(xiàn)miRNA基因的表達(dá)與多種自身免疫性疾病有關(guān)，并且可能參與調(diào)控RA的發(fā)病及疾病發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)[15]，miRNA146a在RA患者中的外周血單核細(xì)胞中表達(dá)明顯高于正常人，且與RA患者疾病活動性相關(guān)的血沉、C反應(yīng)蛋白、TNFα表達(dá)呈正相關(guān)，顯然miRNA146a的表達(dá)水平與RA的發(fā)病有著直接聯(lián)系。Stanczyk等[16]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA203基因在RA患者中有促進(jìn)炎癥的發(fā)生和關(guān)節(jié)破壞的作用，主要是它在滑膜組織中的高表達(dá)引起MMP及IL6的產(chǎn)生增多，而MMP及IL6在RA的診斷中有著重要價值。Niederer等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA34的表達(dá)水平與RA患者滑膜成纖維樣細(xì)胞的凋亡有著密切的聯(lián)系，并通過實(shí)驗(yàn)證明miRNA34的表達(dá)水平上調(diào)可抑制滑膜成纖維樣細(xì)胞的凋亡。而miRNA34主要是通過自身的高表達(dá)引起其靶蛋白X連鎖凋亡抑制蛋白（Xlinked inhibito of apoptosis protein，XIAP） 的表達(dá)上調(diào)，并且XIAP的表達(dá)抑制RA患者滑膜成纖維樣細(xì)胞的凋亡。荀春華等[18]通過定量PCR檢測技術(shù)檢測血漿及外周單個核細(xì)胞（PBMC）中四種miRNA（miR146a、miR223、miR16、miR155）的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RA患者的PBMC中，四種miRNA的表達(dá)均上調(diào)。同時，還有研究發(fā)現(xiàn)[19]miR155高表達(dá)可抑制MMP1及MMP3的產(chǎn)生，從而對抗RA患者關(guān)節(jié)的破壞。

2.4 miRNA與骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)性

骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是多因素共同作用下導(dǎo)致成骨與破骨的平衡被打破后引起的以骨量減少，骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退化、破壞為主要特征的全身性代謝性骨髂疾病。在2009年國際骨質(zhì)疏松癥基金會上首次報告了亞洲人群的骨骼健康狀況，并指出在中國骨質(zhì)疏松的患者將逐年增長。OP多發(fā)于老年人，其導(dǎo)致骨骼的強(qiáng)度降低且脆性增高，從而導(dǎo)致骨折的高發(fā)，而骨折常常成為老年人致命的打擊。目前人們對OP的認(rèn)識仍有限，因而OP的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防、治療等方面的研究仍待深入。影響OP發(fā)生、發(fā)展的因素很多，如遺傳因素、內(nèi)分泌系統(tǒng)因素、營養(yǎng)狀況、運(yùn)動負(fù)荷等等。而近年來，人們的目光逐漸轉(zhuǎn)移到微觀環(huán)境中來，研究發(fā)現(xiàn)OP與miRNA在骨組織中的表達(dá)有一定的聯(lián)系。多個miRNA參與了成骨細(xì)胞的分化成熟過程，如miRNA503、miRNA3960通過對破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控，在骨質(zhì)疏松的發(fā)生過程中有著密切的聯(lián)系[20]。而早在2008年LI等人[21]在BMP2誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)現(xiàn)了有多種miRNA的參與，其中25個miRNA中有22個表達(dá)下調(diào)，且具體作用機(jī)制當(dāng)時仍不清楚。Mizuno等[22]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miRNA210在BMP4誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞ST2 成骨分化過程中表達(dá)明顯上調(diào)。后來另有研究發(fā)現(xiàn)[23]miRNA1423p基因的表達(dá)可抑制APC 基因的蛋白表達(dá)并且激活Wnt通路，從而增強(qiáng)hFOB1.19細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可見miRNA1423p基因的表達(dá)量與成骨分化呈正相關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)miRNA29b、miRNA26a、miRNA30a5p、miRNA2861、miRNA20b等均有促進(jìn)細(xì)胞成骨分化的作用。與此同時，也有研究發(fā)現(xiàn)許多miRNA在成骨過程中起著負(fù)調(diào)控的作用。老年女性絕經(jīng)后OP患者的骨骼標(biāo)本中的miRNA表達(dá)水平發(fā)生了明顯的變化，miRNA214水平明顯增高，且其表達(dá)與成骨呈負(fù)相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[24]小鼠原代成骨細(xì)胞在體外礦化過程中發(fā)現(xiàn)了miRNA93的表達(dá)明顯降低，且負(fù)調(diào)控成骨細(xì)胞體外礦化能力。Eskildsen等[25]研究發(fā)現(xiàn)miRNA138可抑制成骨，其主要是通過抑制FAKERK1/2信號通道，導(dǎo)致下游的Runx2和OSX的磷酸化作用降低，從而抑制成骨骨分化。

3 小結(jié)

miRNA在人的體液、骨骼、肌肉等多種組織、器官中持續(xù)且穩(wěn)定的存在，研究發(fā)現(xiàn)miRNA與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及治療有著密切的關(guān)系，可作為多種疾病輔助診斷和判斷預(yù)后的新標(biāo)記物。而miRNA在骨科疾病中的過高或過低的表達(dá)，為我們提供了新的思路，雖然目前在骨肉瘤的研究中發(fā)現(xiàn)了許多重要的miRNA，但要在骨肉瘤的診斷、治療上起到歷史性變革作用的發(fā)現(xiàn)仍需繼續(xù)深入研究。而在骨質(zhì)疏松癥的問題上，miRNA也表現(xiàn)頗為突出，研究發(fā)現(xiàn)了促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化的miRNA，這必將成為后期抗骨質(zhì)疏松治療的一個新的靶點(diǎn)。但至今仍沒有很好的方法去早期診斷和排除骨質(zhì)疏松癥，所以還需要很多努力。同時miRNA在關(guān)節(jié)疾病中的重要作用也逐步得到闡釋，它與OA患者的關(guān)節(jié)軟骨平衡有著密切的聯(lián)系，所以若能通過miRNA基因的調(diào)控解決軟骨細(xì)胞的修復(fù)、再生等問題，這將為骨性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等患者送去佳音。筆者相信，通過人類的共同努力，在不久的未來，這些難題都將被一一攻克。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2015-08-18 修回日期：2015-10-22）

（編輯：潘明志）