香蕉MaTET基因的克隆與表達分析

姜成東等

摘 要 采用RACE技術克隆香蕉果實采后成熟相關基因MaTET的全長cDNA，利用生物信息學方法分析MaTET基因及推導蛋白的序列，再利用RT-PCR技術對該基因的組織器官表達特性和在果實采后成熟過程中的表達特性進行分析。結果表明，MaTET的cDNA序列全長為1 234 bp，包含一個852 bp的完整開放閱讀框，編碼283個氨基酸殘基，5′端非編碼區(qū)222 bp，3′端非編碼區(qū)160 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。MaTET蛋白具4個跨膜區(qū)域，屬于四跨膜蛋白（Tetraspanins），擁有多個與信號傳導有關的修飾位點，在系統(tǒng)發(fā)生上更接近鷹嘴豆、野草莓和番茄等雙子葉植物。MaTET可在香蕉根、莖、葉、花以及果實中表達，在根和葉中的表達量高于其它器官；MaTET在自然成熟香蕉果實中的微黃（TY）階段開始上調表達，在黃多于綠（MY）階段表達量急遽升高，隨后降低，乙烯可增強MaTET表達且表達高峰提前至綠多于黃（MG）階段，1-MCP抑制MaTET的表達。

關鍵詞 香蕉；四跨膜蛋白；克隆；生物信息學；表達分析

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A

Abstract The objective of this study is to clone the full-length cDNA of a gene（MaTET）involved in postharvest ripening of banana fruit and primarily analyze its function； MaTET cDNA sequence was obtained by the approach of RACE， the putative amino acid sequence were analyzed by bioinformatics software and the expression patterns were analyzed by RT-PCR； Sequence analysis indicated that MaTET gene was 1 234 bp in length with an open reading frame of 852 bp predicted to encode 283 amino acids. MaTET protein belonged to tetraspanins membrane protein characterized with four transmembrane regions. MaTET protein possessed multiple modified sites associated with signal perception and transduction. The phylogenetic analysis showed that MaTET had a closer relationship with Fragaria vesca， Cicer arietinum and Solanum lycopersicum which belong to dicotyledons； MaTET was constitutively expressed in all organs such as roots， corns， leaves， flowers and fruits with higher level in roots and leaves than other organs. MaTET expression level initially enhanced gently in trace yellow（TY）stage then enhanced sharply in more green than yellow（MY）stage followed by a sharply decrease in other stages in natural ripening banana fruit， ethylene treatment induced the expression level and promoted the emergence of expression peak to more green than yellow（MG）stage， and 1-MCP treatment inhibited the expression of MaTET； MaTET gene encoded a protein belonging to tetraspanins family， functions in postharvest ripening process of banana fruit modulated by ethylene.

Key words Banana； Tetraspanins； Clone； Bioinformatics； Expression analysis

四跨膜蛋白（Tetraspanins，TETs），是一類廣泛存在于多細胞生物體內的跨膜蛋白，該類蛋白長度大約為204～355個氨基酸殘基，具有4個高度疏水的跨膜結構，在膜外形成2個環(huán)狀結構[1]。TETs間以及TETs與其它蛋白間相互作用，形成TETs復合體，廣泛地參與到細胞粘附、細胞遷移、細胞信號途徑的激活、促進膜蛋白成熟、細胞增殖以及信號傳導等活動[2-3]。由于TETs的功能與人類的多種疾病形成機制相關，包括癌癥形成機制以及細菌、病毒和寄生蟲對人體感染過程中的免疫反應等[4-7]，因而人的TETs備受重視，研究較多。在植物中，目前通過基因組測序或其它途徑已在擬南芥、玉米、番茄等許多植物中發(fā)現(xiàn)四跨膜蛋白基因，盡管研究相對較少，但其重要性已逐漸引起研究者關注。Wang等[8]通過對植物四跨膜蛋白的生物信息學研究發(fā)現(xiàn)，植物TETs與多細胞動物TETs結構和特征相同，具有四個跨膜結構并在膜外形成2個環(huán)狀結構，兩者主要區(qū)別在于序列相似性較低，此外植物TETs具有不同于其它多細胞生物的保守結構域。

植物中關于TETs的功能研究主要集中于模式植物擬南芥上。Cnop等[9]發(fā)現(xiàn)一個根系、葉片和花嚴重扭曲擬南芥突變株，并利用染色體著陸技術克隆了突變基因TRN1和TRN2，TRN2（ekeko/AtTET1）屬于四跨膜蛋白基因。有研究結果表明，AtTET1的功能與植物的發(fā)育有關，trn2的莖、花、根系嚴重扭曲，同時頂端優(yōu)勢明顯減輕；AtTET1基因對于根表皮上根毛的形成以及側根冠的形成具有重要作用；AtTET1通過影響葉片內生長素的分布與平衡從而影響葉片發(fā)育的對稱性[10-11]；AtTET1基因的突變影響到莖頂端分生組織周邊區(qū)細胞的分化[12]。Boavida等[13]研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的17個TETs基因呈現(xiàn)出豐富的組織器官表達特性，表明植物TETs功能可能涉及多種生理機制。

目前雖對擬南芥AtTET1的功能有較深入的了解，但多數植物TETs的研究尚未見報道。本課題組利用抑制差減雜交技術，對采后2 d香蕉果實差異表達基因進行研究，獲得了一段在香蕉采后上調表達的EST序列[14]。本研究根據該EST序列，克隆了一個TET基因的cDNA序列全長，對其進行生物信息學分析，并分析該基因在香蕉組織器官中以及在香蕉果實采后后熟過程中的表達特性，為植物中TETs功能的研究提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆所用模板為本實驗室保存的香蕉果實cDNA文庫。

克隆載體為TaKaRa公司的pMD-18T，大腸桿菌DH5α 為中國熱帶農業(yè)科學院生物技術研究所自行保存菌株。

組織器官特異性分析所用材料為香蕉主栽品種巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）。選取雌花花后發(fā)育約100～110 d，處于綠熟階段，棱角明顯約七成熟果實植株的白色肉質根、球莖、葉片、雌花以及果實進行器官特異性分析。各器官用無菌水清洗后立即用液氮速凍。

采收的果實運到實驗室，落梳切成單果指，選大小均勻的果指先用5 g/L的漂白粉處理10 min，晾干，再用0.1%的多菌靈浸泡10 min，晾干后將果實分成3組進行處理。第1組為自然成熟的果實：將果實放入聚乙烯薄膜袋中，不封口，置于22 ℃的貯藏庫中。第2組為催熟的果實：用100 mL/L的乙烯利（乙烯釋放劑）浸泡果實5 min，晾干后將果實放入聚乙烯薄膜袋中，不封口，然后置于22 ℃貯藏庫中。第3組為1-MCP抑制成熟的果實： 每袋用1 μL/L 1-MCP處理24 h，封口后置于22 ℃貯藏庫中。第一組，第二組按成熟度取樣，第三組每4 d取1次樣。樣品用液氮速凍，-75 ℃保存?zhèn)溆?。果實成熟度參考Stover 等的方法[15]，成熟過程中的先后順序依次為：1、全綠（full green， FG），2、微黃（trace yellow，TY），3、綠多于黃（more green than yellow， MG），4、黃多于綠（more yellow than green， MY），5、柄綠（green tip， GT），6、全黃（full yellow， FY），7、黃帶褐斑（yellow flecked with brown spots， YB）。

1.2 方法

1.2.1 目的基因全長cDNA序列的克隆 根據已獲得的香蕉果實采后2 d上調表達的EST片段，設計5′端和3′端RACE引物，5′RACE外側引物GSP5：5′-CTGTTTGGGTCTGATGGGTTGT-3′；5′RACE內側引物NGSP5：5′-GGACGATGGTCAAGA

GTGCC-3′。3′RACE外側引物GSP3：5′-ACCTGT

TCTTGGCACTCTTGAC-3′；3′RACE內側引物NGSP3：5′-ACAACCCATCAGACCCAAACAG-3′。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，回收純化后連接到載體送上海生物工程服務有限公司測序。將獲得的5′端和3′端序列拼接后設計全長基因5′端和3′端引物，擴增cDNA全長序列。5′端引物為：5′-GAAGGACGACGAAAAAACGACG-3′，3′端引物為：5′-GGGCGATGAGATTTTTCCGTTG-3′。

1.2.2 香蕉MaTET序列的生物信息學分析 利用美國國立生物技術信息中心（NCBI）網站中的BlastX對序列進行比對，選取同源性>30%的序列進行系統(tǒng)進化分析。利用Protparam在線分析軟件進行蛋白理化性質分析，利用TMHMM在線分析軟件對MaTET蛋白進行跨膜區(qū)預測。利用Clustal1.81和Mega3.0軟件構建MaTET蛋白與其它植物TET的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 RNA提取 香蕉果實和花RNA的提取采用改良的CTAB法[16]。香蕉營養(yǎng)器官球莖、葉片和根系的RNA提取方法采用改良SDS法[17]。

1.2.4 cDNA合成 RNA的反轉錄采用Fermentas的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒合成。具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.5 RT-PCR分析 在所獲全長序列上選取一段特異序列設計引物進行RT-PCR分析，上游引物：5′-CCGAGGAGAAGCACCACCAC-3′；下游引物：5′-GCCACCGCTGCAGCGATCTCCTC-3′。內參基因為香蕉Actin， 上游引物為：5′-TGTAGCAATT

CAGGCTGTTCTT-3′；下游引物為：5′-TCAGAGAT

GGCTGGAAGAGAAC-3′。

2 結果與分析

2.1 MaTET基因cDNA序列的克隆及生物信息學分析

基于已獲得的香蕉EST序列片段，通過5′端和3′端 RACE，分別擴增出目的基因的3′端和5′端（圖1-A、B），拼接出目的基因cDNA全長后，在目的基因的5′端和3′設計引物擴增出目的基因（圖1-C）。該基因全長1 234 bp，包含一個852 bp的完整開放閱讀框，編碼283個氨基酸殘基的蛋白質，5′端非編碼區(qū)222 bp，3′端非編碼區(qū)160 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，N端帶有信號肽（圖2）。經blast比對，InterProScan分析，確認該目的基因的表達產物為四跨膜蛋白（Tetraspanins），并將該基因命名為MaTET。

MaTET蛋白的分子式為C1 441H2 221N365O404S13，相對分子質量為31 539.4，等電點為4.95，理論推導半衰期大于10 h。不穩(wěn)定參數為40.72，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中相對含量比較多的氨基酸是Leu（34個，12%），Ser（22個，7.8%）， Ile（22個，7.8%）Ala（21個，7.4%），Val（20個，7.1%）。Pyl和Sec含量為0?？偟膸ж撾姾傻臍埢ˋsp+Glu）為31，總的帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為22，親水性平均數為0.262，預測該蛋白為水不溶性蛋白。

MaTET跨膜區(qū)預測結果見圖3。MaTET具有4個跨膜結構，分別位于13～35、85～107、114～136和165～188氨基酸殘基序列處。MaTET的N端和C端均位于膜內，N端有8個氨基酸殘基，C端有95個氨基酸殘基。MaTET在264～267氨基酸殘基處存在一個N-糖基化位點（NRSH），在 140～142處和24～26處有2個蛋白激酶C磷酸化位點， SWK和SQR，存在4個酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，分別是SSSD（40～43）、SFLD（74～77）、SDDE（199～203）、SRND（236～239），4個N端豆蔻?；稽c，GLWECL（5～10）、GCCLSC（111～116）、GAPATG（219～224）、GLDTSE（250～255），一個原核生物膜脂蛋白脂結合位點，GIGVVLFIISC（90～100）；一個含異戊（間）二烯基群結合位點，CIIM（280～283）。Target P 1.1 Server分析表明，香蕉MaTET可能定位于膜上，定位于線粒體內膜、葉綠體類囊體膜、質膜、線粒體膜上的可能性分別為67.5%、66.6%、60%及47%。

根據香蕉MaTET和其它物種推導的TET氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)生樹的結果見圖4。全部序列可被分為6個大簇（clades），鷹嘴豆（CaTET XP004495030）、番茄和野草莓為一個簇；水稻、玉米和谷子為一個簇；可可、谷子為一個簇；鷹嘴豆（CaTET XP004511769）和MaTET單獨構成一個簇。MaTET與鷹嘴豆（CaTET XP004495030）、番茄、野草莓所構成的簇親緣關系較近，與可可、擬南芥構成簇的親緣關系較遠。

2.2 MaTET基因的表達特性分析

2.2.1 MaTET基因組織器官表達特性 MaTET的器官表達特性分析結果見圖5。MaTET基因在香蕉根、球莖、葉、花、果實等器官中均表達。MaTET在球莖、花、果中的表達量較低，在根和葉中的表達量較高。

2.2.2 果實成熟過程中MaTET基因的表達 香蕉后熟各階段成熟度見圖6-A。各處理的后熟過程經歷時間不同，自然后熟（對照）經16 d達到YB階段，乙烯利處理僅需6 d即達到YB階段，而1-MCP處理直至處理24 d時果實仍為綠色，但果實已軟化、腐爛，因此在第24天時結束實驗。

自然后熟的香蕉經過16 d完成全部后熟過程，MaTET基因在果實后熟過程中的表達特性見圖6-B。香蕉果實自然后熟的過程中，MaTET基因在各級成熟度的香蕉中均表達。在后熟過程中，MaTET基因的表達量呈現(xiàn)出先上升隨后降低的躍變型特征，即在TY階段表達量開始升高，成熟度達到MY階段表達量急遽上升達到最高，隨后在第TG、FY、YB階段又降低。

在乙烯處理條件下，香蕉果實后熟過程加快，1 d后達到TY階段，在6 d內完成全部后熟過程。在乙烯誘導后熟過程中MaTET表達規(guī)律與自然成熟類似，即呈先上調表達再降低趨勢（圖6-C），但MaTET在MG階段時表達量急遽上升，達到最高。此外，乙烯誘導成熟過程中MaTET在表達高峰MG階段的表達量明顯高于自然成熟中表達高峰MY階段的表達量，其它各級成熟度中的表達量也都明顯高于自然成熟香蕉中的表達量。

1-MCP是乙烯受體抑制劑，可以強烈地抑制香蕉果實成熟。本實驗中，1-MCP處理香蕉成熟被強烈抑制，處理后24 d時香蕉果皮仍為綠色。MaTET基因在1-MCP處理香蕉中表達量始終極低，僅在處理24 d時略上調表達，表明1-MCP在抑制香蕉后熟的過程中也抑制了MaTET基因的表達。

3 討論與結論

本研究從香蕉中克隆了一個四跨膜蛋白編碼基因的cDNA序列，命名為MaTET。該基因推測的編碼蛋白MaTET長度為283個氨基酸殘基，和動物、人類、真菌等生物中的四跨膜蛋白長度相符[2]。MaTET為水不溶性蛋白，這與其膜蛋白的特性相符。MaTET具有TETs的典型特征，即具有4個高度疏水的跨膜結構，N端和C端均在膜內，膜外形成一大（LEL）一?。⊿EL）2個環(huán)狀結構。LEL長度為49個氨基酸殘基，SEL長度為28個氨基酸殘基。MaTET大環(huán)的長度較人類LEL的短，而小環(huán)的長度較人類SEL的長。人類TETs中LEL長度大約占到全序列的1/3～1/2[2]，而MaTET的LEL長度僅為序列的1/6，表明植物MaTET的功能與其它生物不同，功能可能較少或更具特異性。

蛋白質翻譯后的化學修飾對于蛋白的功能具有重要意義。MaTET上具有多個蛋白質修飾位點，如N-糖基化、酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化、豆蔻?；彤愇於┗?。糖基化是蛋白翻譯后的重要修飾現(xiàn)象，N-糖基化位點對與蛋白的相互作用、表達、分泌和結構的穩(wěn)定具有重要作用[18-19]。MaTET上具有N-糖基化位點表明，MaTET可能通過與其它蛋白作用行使功能，這與TETs通常形成復合體行使功能的特性相符合。酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化可以影響到擬南芥HFR1轉錄因子的穩(wěn)定性和信號傳導活性[20]，豆蔻?；悄さ鞍锥ㄎ挥谀ど纤仨毿揎梉21-22]且可以調節(jié)鈣結合鈣調素和酪氨酸蛋白激酶pp60v-src之間的相互作用，在信號傳導中具有重要作用[23]，蛋白質異戊二烯化和信號傳遞或腫瘤發(fā)生有關[24]。MaTET上存在多種與信號傳導相關的修飾位點，表明MaTET可能在膜內外信號傳導上起著重要作用。

大部分四跨膜蛋白的胞內區(qū)較短，通常少于19個氨基酸殘基[1-2]，如此短的序列上缺乏常規(guī)的與信號傳導有關的結構域，因此一般認為四跨膜蛋白不直接參與信號傳導。但Lapalombella等[3]對四跨膜蛋白CD37的研究表明，CD37可以直接參與導致細胞凋亡的信號傳導。MaTET的胞內區(qū)C端較長，具有94個氨基酸殘基，而且該片段上還有兩個酪氨酸（Tyr）蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位點，進一步說明MaTET基因功能與信號傳導有關，且可能直接參與信號傳遞。

系統(tǒng)發(fā)生分析表明，MaTET在系統(tǒng)發(fā)生上和雙子葉植物鷹嘴豆、野草莓、番茄構成的同源簇的親緣關系較近，而與同為單子葉植物的水稻、玉米和谷子構成的同源簇親緣關系較遠，表明MaTET在進化上比較保守。此外在鷹嘴豆、野草莓、番茄構成的同源簇中野草莓和番茄的果實同香蕉相同，都為漿果，表明MaTET的功能可能與果實類型有關。

MaTET是根據香蕉采后抑制差減雜交分析所獲得的一個EST序列，從香蕉果實cDNA文庫中克隆所得。為明確MaTET在香蕉果實后熟過程中的表達特性，本研究對自然成熟過程中MaTET的表達特性進行了分析。MaTET的表達在自然成熟的香蕉果實中呈現(xiàn)出隨成熟度增加而先上升再下降的特性，這一表達特性同許多香蕉后熟相關基因如ACS[25]以及MS[26]等的表達特性相似，說明MaTET功能可能與香蕉后熟相關。乙烯是香蕉成熟的重要促進物質，香蕉果實后熟過程中伴隨著乙烯的合成，外源乙烯處理可以迅速促進香蕉果實內乙烯合成，加快果實成熟[27]。為分析MaTET在香蕉果實成熟過程中的表達是否受乙烯調控，本研究分別利用乙烯和1-MCP處理香蕉，分析了MaTET在這2種處理下的表達特性。乙烯處理香蕉中MaTET的表達特性同自然成熟香蕉類似，即表達量急遽升高隨后迅速下降，但乙烯處理使得MaTET的表達高峰提前出現(xiàn)在MG階段，而且其表達量要明顯高于自然成熟，表明該基因的表達受到乙烯強烈誘導。1-MCP是乙烯抑制劑，其不可逆地作用于乙烯受體， 阻斷乙烯與乙烯受體的正常結合，抑制其所誘導的果實后熟[28]。1-MCP處理的香蕉果實中MaTET一直處于較低的表達水平，表明MaTET的表達因乙烯受體與1-MCP結合而受到抑制，進一步說明MaTET在香蕉采后成熟過程中的表達受到乙烯的調控。

香蕉采后成熟是一個復雜的生理生化過程，在此過程中多種基因參與了果實的成熟調控且受乙烯的誘導，這些基因包括ACC合成酶（ACS）、ACC氧化酶（ACO）[29]，磷酸蔗糖合成酶[30]，果膠裂解酶[31]，蘋果酸合成酶[32]以及檸檬酸合成酶[33]等。然而有關四跨膜蛋白參與香蕉果實成熟的研究尚未見報道。值得注意的是，在Jin等[34]分析香蕉后熟過程中乙烯高峰初始期差異表達的基因，de Godoy等[35]利用抑制差減雜交技術（SSH）分析香蕉果實成熟中差異表達的基因，以及Toledo等[36]利用蛋白質組學技術分析香蕉果實成熟過程中差異表達的蛋白時，均未檢測到MaTET基因或MaTET蛋白的上調表達，這可能與各研究香蕉果實采樣時間或技術的局限所導致。

本研究不但表明MaTET是受乙烯調控的與香蕉果實后熟相關基因，而且在進行生物信息學分析時發(fā)現(xiàn)MaTET蛋白具有多個與信號傳導有關的位點，顯示MaTET可能參與到香蕉成熟過程中信號轉導過程，此外MaTET在香蕉的各種器官中均有表達，因此，MaTET還可能與除果實外的其它器官的功能有關，其具體機制有待進一步深入研究。

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