柑橘潰瘍病菌LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

封立平等

摘 要 以柑橘潰瘍病菌特異性高的假定蛋白基因（登錄號(hào)：AE008923.1）為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)并篩選4條引物來(lái)特異性識(shí)別靶標(biāo)序列中的6個(gè)獨(dú)立區(qū)域，建立柑橘潰瘍病菌LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法。該方法利用實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂白色沉淀，實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個(gè)變量參數(shù)對(duì) LAMP檢測(cè)體系進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)方法的特異性、靈敏度、穩(wěn)定性及實(shí)際樣品檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，該體系經(jīng)優(yōu)化后穩(wěn)定性良好，可在66 ℃ 恒溫條件下，60 min內(nèi)完成檢測(cè)；DNA檢測(cè)下限可達(dá)0.02 ng/μL，靈敏度與熒光定量PCR方法相同，比常規(guī)PCR方法高1個(gè)數(shù)量級(jí)；能快速、準(zhǔn)確地對(duì)田間疑似樣品進(jìn)行檢測(cè)，與熒光定量PCR方法的檢出情況一致，沒(méi)有漏檢。結(jié)果說(shuō)明柑橘潰瘍病菌實(shí)時(shí)濁度LAMP檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、所需時(shí)間短，特異性與靈敏度高，為柑橘潰瘍病菌的快速篩查提供較好的途徑。

關(guān)鍵詞 LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法；柑橘潰瘍病菌；檢測(cè)

中圖分類號(hào) S 436.661.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The conserved hypothesis protein sequence published in GenBank（accession no.AE008923.1）of Xanthomonas axonopodis pv. citri was used to design a set of four special primers that recognized six distinct sequences of the conserved region of X. axonopodis pv. citri genome， and a real-time turbidity method for rapid detection of X. axonopodis pv. citri by loop-mediated isothermal amplification（LAMP）was established. Real-time monitoring of magnesium pyrophosphate produced from the LAMP reaction was achieved by the turbidimeter.The LAMP detection system was optimized by five variable parameters： magnesium ion concentration， dNTPs concentration， betaine concentration， primer concentration and reaction temperature， and the specificity， sensitivity， stability， and effect on real samples of this method were evaluated. Results showed that after optimizing the detection system the stability was good and detection was completed at 66 ℃ in 60 minutes.The lowest DNA detection limit was 0.02 ng/μL，with the same sensitivity as the real time Q-PCR method， but 10 times higher than the PCR method. This method could do field detection of suspected samples quickly and accurately， consistent with the fluorescence PCR detection methods without any missing cases. The LAMP real-time turbidity detection method is easy and quick to operate， with high specificity and sensitivity， and provides a good method for the rapid screening of X. axonopodis pv. citri. LAMP Real time turbidity method established in this study is a new method of LAMP detection of X. axonopodis pv. citri， has not been reported at home and abroad.

Key words LAMP real-time turbidity method； Xanthomonas axonopodis pv. citri； Detection

由地毯草黃單胞柑橘致病變種[Xanthomonas axonopodis pv. citri（Hasse） Vauterin et al.，簡(jiǎn)稱柑橘潰瘍病菌]引起的柑橘潰瘍?。╟itrus bacterial canker disease，CBCD）是中國(guó)重要的檢疫性有害生物，對(duì)柑橘生產(chǎn)危害極大，世界大部分國(guó)家對(duì)該病菌都有嚴(yán)格的檢疫要求。該病目前廣泛分布于亞洲、太平洋、印度洋島國(guó)、非洲、南美洲和北美洲的30多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。在中國(guó)已有14個(gè)省市（包括臺(tái)灣）的柑橘產(chǎn)區(qū)有該病發(fā)生，尤以甜橙、柚和柑發(fā)生較嚴(yán)重[1-2]。

柑橘潰瘍病菌，即舊的細(xì)菌分類系統(tǒng)中Xanthomonas campestris pv. citri中的A菌系，目前在Vauterin的新分類系統(tǒng)中被劃分在地毯草黃單胞桿菌（Xanthomonas axonopodis）[3]。柑橘潰瘍病菌侵染未老化的葉片、新梢和幼果形成病斑，嚴(yán)重時(shí)引起落葉、落果和枝梢枯死。同時(shí)，果實(shí)受害后還會(huì)影響外觀、降低商品價(jià)值。柑橘潰瘍病菌還有潛伏侵染現(xiàn)象，給此病的檢疫、采穗和防治工作帶來(lái)困難。柑橘潰瘍病發(fā)生后，沒(méi)有有效的防治辦法，只能通過(guò)砍樹(shù)燒毀等措施杜絕病害蔓延，對(duì)果農(nóng)的利益造成極大的沖擊[4]。因此迫切需要建立一種簡(jiǎn)單可靠的快速篩選方法，以便更好地對(duì)該菌進(jìn)行檢疫和監(jiān)測(cè)，為柑橘潰瘍病的防控提供可靠的資料和數(shù)據(jù)。

長(zhǎng)期以來(lái)科研人員已對(duì)柑橘潰瘍病進(jìn)行了多種檢測(cè)方法的研究。ELISA檢測(cè)技術(shù)方法[5]、普通PCR檢測(cè)方法[6]、熒光定量PCR檢疫檢驗(yàn)方法[7-8]、滾環(huán)擴(kuò)增檢測(cè)方法[9]、分子指紋圖譜鑒別方法[10-11]等已被應(yīng)用于柑橘潰瘍病菌的檢測(cè)。一些新的檢測(cè)手段如脂肪酸色譜圖檢測(cè)法、激光檢測(cè)法、噬菌體檢驗(yàn)方法[12]等也相繼展開(kāi)，但這些檢測(cè)技術(shù)普遍存在檢測(cè)周期長(zhǎng)、假陽(yáng)性和誤判率高、靈敏度差、儀器設(shè)備昂貴、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)，限制了其在基層的推廣。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification， LAMP）是日本榮研化學(xué)株式會(huì)社Notomi等[13]在2000年發(fā)明并建立的一種新型核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，檢測(cè)結(jié)果只通過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判別，在恒溫條件下，15～90 min內(nèi)可擴(kuò)增 109～ 1010倍，免去了反復(fù)升溫降溫的過(guò)程，使得擴(kuò)增過(guò)程更加簡(jiǎn)便。LAMP技術(shù)目前已在病原微生物的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用[14-15]。

起初，LAMP技術(shù)主要是利用水浴鍋和金屬浴等加熱裝置反應(yīng)，觀察LAMP反應(yīng)中的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀，或者通過(guò)SYBR Green I染料顯色進(jìn)行結(jié)果判定，但由于LAMP高溫反應(yīng)產(chǎn)生的氣溶膠容易導(dǎo)致污染，后來(lái)發(fā)展了不開(kāi)蓋檢測(cè)技術(shù)來(lái)避免污染。隨著LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c等濁度儀的開(kāi)發(fā)利用，人們開(kāi)始采用濁度儀對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量分析。因?yàn)镈NA濃度、焦磷酸鎂、濁度三者呈線性相關(guān)，因此可依據(jù)DNA和濁度之間的相關(guān)性構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的檢測(cè)[16-17]。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是在恒溫條件下1 h即可完成擴(kuò)增，耗時(shí)短，并可通過(guò)設(shè)置分析標(biāo)準(zhǔn)排除假陽(yáng)性和非特異性反應(yīng)等干擾引物，使得檢測(cè)結(jié)果更加有效、準(zhǔn)確，是新一代的LAMP檢測(cè)方法[18-19]。本研究建立了柑橘潰瘍病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri的LAMP實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)方法，對(duì)優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行了特異性、靈敏性和穩(wěn)定性檢測(cè)，同時(shí)與PCR檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了靈敏度的比較。該方法為口岸和基層實(shí)驗(yàn)室檢疫和監(jiān)測(cè)柑橘潰瘍病菌，防止病菌傳入侵風(fēng)險(xiǎn)，保證無(wú)病苗木繁育和生產(chǎn)提供了新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 感染柑橘潰瘍病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）的柑橘葉片由中國(guó)農(nóng)科院柑橘研究所贈(zèng)送，柑橘黃龍病菌亞洲種（Candidatus Liberobacter asiaticum）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、短波單胞桿菌（Brevundimonas segers）、鞘胺醇單胞嗜冷桿菌（Psychrobacter sp.）、水稻細(xì)條病菌（Xanthomons. oryzae pv. oryzicola）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）均由重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。野油菜黃單胞桿菌（Xanthomons campestris pv. campestris）、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌（Clavibater michiganensis）、大白菜軟腐病菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora）均由山東出入境檢驗(yàn)檢疫局植物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑與儀器 WizardR Genomic DNA Purification Kit、Bacterial DNA Kit和小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；Taq DNA Polymerase、dNTP Mixture、MgCl2、PCR buffer購(gòu)自Promega公司；LAMP DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自日本榮研化學(xué)株式會(huì)社；DNA Marker（DL2000）購(gòu)自寶生物（大連）有限公司；LB液體培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）、水浴鍋（南通凱達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、空氣浴搖床、球磨儀（德國(guó)Retsch公司）、電泳儀（美國(guó)BioRad公司）、凝膠成像系統(tǒng)[西盟生命技術(shù)（國(guó)際）有限公司]、LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c（日本榮研化學(xué)株式會(huì)社）、熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）、PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取小片新鮮病葉組織，經(jīng)表面消毒后剪碎，放入充分預(yù)冷的研缽中， 加入液氮迅速研磨至粉末狀，用promega wizard基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)巴西Silva等報(bào)道的柑橘潰瘍病菌染色體全基因組序列（登錄號(hào)：AE008923.1）與野油菜黃單胞菌（X. campestris pv. campestris）全基因組序列（登錄號(hào)：AE008922.1）的同源性比對(duì)，選擇柑橘潰瘍病菌特異性高的假定蛋白（hypothesis protein）基因，利用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4.0（http：//primerexplorer.jp/e/），根據(jù)Tm值、各引物的末端安定性、GC對(duì)含量、引物間距離、二次結(jié)構(gòu)等條件設(shè)計(jì)5組LAMP引物，引物序列見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。按照榮研LAMP試劑盒體系配制反應(yīng)體系，用LAMP RealTime Turbidimeter LA-320c對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，根據(jù)陽(yáng)性樣品的反應(yīng)時(shí)間、擴(kuò)增速率、引物組的非特異性擴(kuò)增等條件進(jìn)行5組引物的篩選。反應(yīng)條件設(shè)定為62 ℃（根據(jù)Bst酶推薦的擴(kuò)增溫度為60～65 ℃的特性確定）60 min。

1.2.3 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化方法 參照國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[15-19]，初步確定25 μL的LAMP反應(yīng)體系，其成分包括：基礎(chǔ)反應(yīng)液12.5 μL，F(xiàn)3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，F(xiàn)IP、BIP（100 μmol/L）各0.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水7.5 μL。反應(yīng)條件為66 ℃ 60 min?；A(chǔ)液反應(yīng)成分及濃度為：20 mmol/L Tris-HCl（pH=8.8，25 ℃），20 mmol/L KCl，20 mmol/L（NH4）2SO4，1% Tween-20，1.5 mol/L Betaine，2.5 mmol/L dNTPs，15 mmol/L MgSO4。

從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個(gè)變量參數(shù)進(jìn)行單因素變化實(shí)驗(yàn)，對(duì) LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

（1）鎂離子濃度優(yōu)化：設(shè)置鎂離子濃度梯度依次為12、14、16、18、20 mmol/L；

（2）甜菜堿濃度變化：甜菜堿的濃度分別設(shè)定為2.4、2.6、2.8、3.0、3.2 mol/L；

（3）dNTPs濃度優(yōu)化：dNTPs的濃度分別設(shè)定為2.2、2.4、2.6、2.8、3.0 mmol/L；

（4）引物濃度優(yōu)化：固定外引物F3、B3的用量（5 pmol）不變，設(shè)置內(nèi)引物FIP、BIP的用量以20、30、40、50、60 pmol依次遞增；

（5）反應(yīng)溫度優(yōu)化：將反應(yīng)溫度梯度設(shè)定為58、60、62、64、66、68 ℃；

利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，收集擴(kuò)增起始時(shí)間、最大擴(kuò)增速率等信息進(jìn)行顯著性分析。

1.2.4 特異性分析 分別以柑橘潰瘍病菌（X. axonopodis pv. citri）、柑橘黃龍病菌亞洲種（Ca. Liberobacter asiaticum）、野油菜黃單胞桿菌（X. campestris pv. campestris）、短小芽孢桿菌（B. pumilus）、短波單胞桿菌（B. segers）、鞘胺醇單胞菌（S. sp.）、成團(tuán)泛菌（P. agglomerans）、嗜冷桿菌（P. sp.）、水稻細(xì)條病菌（X. oryzae pv. oryzicola）、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、蠟質(zhì)芽孢桿菌（B. cereus）、番茄細(xì)菌性潰瘍病菌（C. michiganensis）、大白菜軟腐病菌（E. carotovora subsp. carotovora）的DNA為模板，用篩選出的引物及溫度條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，評(píng)價(jià)引物的特異性。

1.2.5 靈敏度分析 將提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA稀釋至 20 μg/mL，然后10倍梯度稀釋到10-7，采用以上優(yōu)化的體系進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。同時(shí)按照SN/T 2622-2010《柑橘潰瘍病菌檢疫鑒定方法》[20]進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和熒光定量 PCR擴(kuò)增，比較LAMP體系與PCR體系基因組DNA檢測(cè)的靈敏度。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 為評(píng)價(jià)該LAMP檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，采用同一批提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA作為模板進(jìn)行為期一周的穩(wěn)定性試驗(yàn)，每天1次，每次3個(gè)重復(fù)，用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c收集開(kāi)始擴(kuò)增時(shí)間，計(jì)算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。

1.2.7 擴(kuò)大試驗(yàn) 分別采用LAMP方法、PCR方法、Real-Time PCR方法對(duì)212份柑橘葉片樣品進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)，比較符合率。所采集樣品包括疑似染病的柑橘葉片樣品和無(wú)染病癥狀的柑橘葉片樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

實(shí)時(shí)擴(kuò)增圖見(jiàn)圖1，5組引物中有ID1、ID3、ID5三組成功擴(kuò)增目的片段，3次重復(fù)結(jié)果見(jiàn)表2所示，ID1引物組平均起始擴(kuò)增時(shí)間為28.08 min，4 min內(nèi)即達(dá)到最大反應(yīng)速率，較其他引物組起始反應(yīng)時(shí)間短，擴(kuò)增速率高，符合LAMP快速反應(yīng)的要求，初步確定為xac-LAMP檢測(cè)用引物。使用ID1號(hào)引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物測(cè)序后經(jīng)比對(duì)顯示，序列與X. axonopodis pv. citri的hypothetical protein基因序列相似度達(dá)100%，表明ID1號(hào)引物組擴(kuò)增準(zhǔn)確及特異。

2.2 LAMP的反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)LAMP Real Time Turbidimeter LA-320c對(duì)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控和信息分析得出最佳參數(shù)為：鎂離子濃度16 mmol/L；甜菜堿濃度2.8 mol/L；dNTPs濃度2.8 mmol/L；反應(yīng)溫度66 ℃。當(dāng)外引物F3、B3的用量為5 pmol，內(nèi)引物FIP、BIP為50 pmol時(shí)，起始反應(yīng)時(shí)間最短，擴(kuò)增效率最高，因此確定引物FIP、BIP、F3與B3的終濃度比為10 ∶ 10 ∶ 1 ∶ 1。根據(jù)上述數(shù)據(jù)，建立最佳反應(yīng)體系，見(jiàn)表3所示。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

用ID1引物組進(jìn)行特異性試驗(yàn)，實(shí)時(shí)擴(kuò)增見(jiàn)圖2，結(jié)果顯示，僅有柑橘潰瘍病菌的 DNA產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，其余13種對(duì)照菌株均未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，表明ID1引物組特異性良好，可以作為xac-LAMP特異性檢測(cè)的引物。

2.4 LAMP與PCR 方法檢測(cè)靈敏度的比較

所建立的xac-LAMP檢測(cè)方法分別與普通PCR方法、實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法進(jìn)行了靈敏度比較試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖3和表4。

從結(jié)果可看出，PCR方法的DNA檢測(cè)下限為10-2，濃度為0.2 ng/μL，LAMP與熒光定量PCR方法的DNA檢測(cè)下限均可達(dá)10-3，可檢測(cè)到0.02 ng/μL的DNA。說(shuō)明本研究所建立的LAMP方法靈敏度與熒光定量PCR方法相同，比常規(guī)PCR方法高1個(gè)數(shù)量級(jí)，顯示出良好的應(yīng)用前景。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)表5的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，為期1周的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果良好，檢測(cè)結(jié)果之間的CV%小于5%，介于0.55%與2.21%之間，說(shuō)明該LAMP檢測(cè)體系的穩(wěn)定性良好。

2.6 擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)果

采集212份柑橘葉片樣品作為試驗(yàn)材料，樣品包括疑似染病的柑橘葉片樣品和無(wú)染病癥狀的柑橘葉片樣品。柑橘葉片樣品經(jīng)表面消毒后剪碎放入充分預(yù)冷的研缽中， 加入液氮迅速研磨至粉末狀，用promega wizard基因組DNA提取試劑盒提取樣品總DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照xac-LAMP檢測(cè)方法對(duì)提取的樣品總DNA進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品2次重復(fù)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果用本研究建立的xac-LAMP檢測(cè)方法檢出陽(yáng)性樣品73份，陰性樣品139份，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢出陽(yáng)性73份，陰性139份，用PCR方法檢出陽(yáng)性56份，陰性樣品156份。由此可知，本研究建立的xac-LAMP檢測(cè)方法與熒光PCR方法的符合率為100%，與常規(guī)PCR方法的符合率為91.98%。

3 討論與結(jié)論

目前已有利用LAMP方法檢測(cè)柑橘潰瘍病菌的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。2010年，董歡[21]基于柑橘潰瘍病菌獨(dú)有的保守蛋白基因設(shè)計(jì)了LAMP特異性引物，并對(duì)該方法特異性和靈敏性進(jìn)行了評(píng)估。2013年，張侖等[22]建立了柑橘潰瘍病菌的普通LAMP及快速LAMP檢測(cè)方法，還應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)柑橘潰瘍病菌進(jìn)行研究[23]。本研究也是采用LAMP方法對(duì)柑橘潰瘍病菌進(jìn)行檢測(cè)，但采用的LAMP技術(shù)不同。本研究通過(guò)濁度儀的精確設(shè)置排除了假陽(yáng)性和非特異反應(yīng)，保證了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。而上述報(bào)道的研究仍停留于2000年初的LAMP檢測(cè)技術(shù)，LAMP檢測(cè)結(jié)果的判定采用的是凝膠電泳方法，耗時(shí)費(fèi)力，因此不是真正的快速檢測(cè)技術(shù)。上述研究也沒(méi)有采用不開(kāi)蓋技術(shù)，由于LAMP高溫反應(yīng)后產(chǎn)生的氣溶膠極易導(dǎo)致污染，因此假陽(yáng)性率高。

在LAMP檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)上，已報(bào)道的柑橘潰瘍病菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)與本研究也存在很多不同。首先，引物的設(shè)計(jì)與前述研究完全不同。本研究基于柑橘潰瘍病菌高度保守的蛋白序列（accession no.AE008923.1）設(shè)計(jì)LAMP引物，通過(guò)濁度圖、擴(kuò)增效率和擴(kuò)增曲線相互印證，篩選出擴(kuò)增效率最佳的一組引物，保證了引物的高度特異。其次，在特異性實(shí)驗(yàn)中提供的對(duì)照菌不同。本研究篩選的引物組對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種、短小芽孢桿菌、短波單胞桿菌等13種對(duì)照菌均未產(chǎn)生擴(kuò)增反應(yīng)，表明LAMP引物組具有很高的特異性。董歡[21]的研究中僅提供了4種對(duì)照菌，對(duì)照菌數(shù)量太少，不能在假陽(yáng)性和假陰性的排除上提供有說(shuō)服力的證據(jù)。另外，在實(shí)際檢測(cè)中的穩(wěn)定性效果不同。本研究從鎂離子濃度、甜菜堿濃度、dNTPs濃度、引物濃度和反應(yīng)溫度5個(gè)變量參數(shù)對(duì) LAMP檢測(cè)體系進(jìn)行了優(yōu)化，保證了檢測(cè)體系的特異性、靈敏度和穩(wěn)定性。該檢測(cè)方法經(jīng)實(shí)際檢測(cè)，結(jié)果之間的變異系數(shù)CV%小于5%。而文獻(xiàn)[21-22]中沒(méi)有經(jīng)過(guò)大量樣本的實(shí)際檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證LAMP檢測(cè)體系的穩(wěn)定性，因此LAMP體系的實(shí)際檢測(cè)效果不明確。對(duì)靈敏度的檢測(cè)限進(jìn)行比較，本研究基因組DNA最低檢測(cè)限可達(dá)0.02 ng/μL，靈敏度與熒光定量PCR方法相當(dāng)，比PCR方法高1個(gè)數(shù)量級(jí)，顯示出了較高的應(yīng)用價(jià)值。田間實(shí)測(cè)試驗(yàn)表明，本研究檢測(cè)結(jié)果與熒光定量 PCR符合率為100%，沒(méi)有出現(xiàn)漏檢。且實(shí)測(cè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立在染病柑橘葉片樣品總DNA的基礎(chǔ)上，靈敏度結(jié)果與實(shí)際情況更接近。該檢測(cè)靈敏度為張侖研究報(bào)道的普通IAMP檢測(cè)體系靈敏度的10倍。雖然張侖報(bào)道快速LAMP檢測(cè)體系的DNA檢測(cè)靈敏度可達(dá)2.03×10-5 ng/μL，但同時(shí)指出由于快速LAMP檢測(cè)體系污染率較高，實(shí)驗(yàn)室對(duì)環(huán)境和操作要求極為嚴(yán)格，因此難以滿足田間大規(guī)模樣品普測(cè)的要求。在董歡[21]與張侖等[22]的研究中，實(shí)驗(yàn)樣品均為純菌菌株DNA，而在實(shí)際檢測(cè)中提取的是總DNA，因此無(wú)法精確評(píng)估實(shí)驗(yàn)的實(shí)際檢測(cè)靈敏度。

綜上所述，本研究建立的LAMP實(shí)時(shí)濁度法是一種全新的柑橘潰瘍病菌的LAMP檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究還可利用鈣黃綠素、SYBR GREEN等染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顯色，通過(guò)反應(yīng)管最終的顏色變化肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，滿足可視化現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。該方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，方便可靠，成本低的特點(diǎn)，作為柑橘的口岸檢疫和生產(chǎn)上的快速篩查手段，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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