卡特蘭 ChCHS1和ChDFR1基因的克隆及表達(dá)分析

王紫珊　周琳　王雁

摘 要 以卡特蘭紫色花品種‘粉女郎（Cattleya hybrid‘Pink Lady）為材料，采用RT-PCR和RACE方法從花瓣中分離得到了一個查爾酮合酶（chalcone synthase， CHS）和一個二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase， DFR）同源基因的cDNA全長，分別命名為ChCHS1和ChDFR1，GenBank登錄號分別為KP171693和KP171694。序列分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：ChCHS1的cDNA全長1 508 bp ，編碼394個氨基酸；ChDFR1基因的cDNA全長1 250 bp，編碼350個氨基酸。同源性檢索和生物信息學(xué)分析表明，這2個基因編碼的蛋白都具有各自的功能位點(diǎn)和保守性特征多肽序列。氨基酸序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，ChCHS1、ChDFR1基因在蘭科中與蕙蘭、石斛蘭關(guān)系最近，與百合科關(guān)系較近。相對實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明，ChCHS1 和ChDFR1都在蕾期表達(dá)量最低，伴隨花朵的開放，表達(dá)量逐漸上升，最終分別在花朵盛開期和接近開放時達(dá)到最高。

關(guān)鍵詞 卡特蘭；查爾酮合酶基因；二氫黃酮醇4-還原酶基因；克隆；表達(dá)分析

中圖分類號 S682.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The full-length cDNA sequences of chalcone synthase（CHS）and dihydroflavonol 4-reductase（DFR）genes were cloned from Cattleya hybrida‘Pink ladyby using RT-PCR and RACE， named ChCHS1 and ChDFR1. The GenBank accession was No. KP171693 and No. KP171694 recpectively. The bioinformatics analysis indicated that ChCHS1 is 1 508 bp in full length， encoding a polypeptide of 394 amino acids while ChDFR1 is 1 250 bp in full length， encoding a 350 predicted amino acids residues. The sequence and homology of GenBank revealed that CHS and DFR had the conserved active sites and the family signture. Sequence and phylogenetic analysis indicated a high degree homeotic between Cattleya and Cymbidium or Dendrobium， and in different family CHS and DFR shared more than 70% homology with Liliaceae. Relative real-time PCR analysis showed that the highest expression of ChCHS1 was when flower was in bloom. When the flower was nearly open， ChDFR1 had a highest abundant transcript. In bud stage， ChCHS1 and ChDFR1 had the low level expression.

Key words Cattleya hybrida； Chalcone synthase gene； Dihydroflavonol 4-reductase gene； Cloning； Expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.07.016

花色是觀花植物最重要的觀賞特征之一，直接影響花卉的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，新奇花色的培育和創(chuàng)造一直是觀花植物育種的重要目標(biāo)和研究熱點(diǎn)[1]。類黃酮是花色形成中最主要的色素種類，也是植物中研究最透徹的第二大次生代謝產(chǎn)物。通過對擬南芥、玉米和矮牽牛等模式植物類黃酮化合物合成突變體進(jìn)行篩選，很多相關(guān)功能基因及調(diào)節(jié)基因得以分離[2-3]，類黃酮生物合成途徑也已非常清楚。在此基礎(chǔ)上，對多種植物花色分子調(diào)控機(jī)理的研究正逐步深入[4-7]。

在類黃酮色素的合成途徑中，查爾酮合成酶 （chalcone synthase， CHS）是一個重要的關(guān)鍵酶，其催化1分子的香豆酰CoA（coumary CoA）與3分子的丙二酰CoA（malonyl CoA）縮合形成4，5，7-三羥基黃烷酮（narigeninchalcone），再經(jīng)過異構(gòu)后在不同酶作用下形成花色素苷、黃酮及異黃酮類等黃酮物質(zhì)。自Reimold等[8]在1983年分離得到了第一個歐芹CHS基因以來，矮牽牛[9]、金魚草[10]、蘭花[11]、金花茶[12]和牡丹[13]等多種觀賞植物的CHS基因也相繼克隆。二氫黃酮醇4-還原酶（dihydroflavonol 4-reductase， DFR）是花色素苷合成途徑下游中的第一個關(guān)鍵酶，可以催化花色素苷必要的前體物質(zhì)二氫山奈酚（DHK）、二氫櫟皮酮（DHQ）、二氫楊梅黃酮（DHM）最終形成矢車菊素、天竺葵素、飛燕草素[2]。目前，利用DFR基因開展花色基因工程育種的報道有很多。Meyer等[14]將玉米中分離得到的DFR基因轉(zhuǎn)入矮牽牛中，最終培育出橘紅色花的矮牽牛植株。Tanaka等[15]將玫瑰中分離的DFR基因轉(zhuǎn)入粉紅色的矮牽牛中得到了開橙紅色的花。Holton[16]將正義DFR基因與正義矮牽牛F3′5′H基因?qū)氚咨目的塑?，最終得到開紫色花的轉(zhuǎn)基因植株。

卡特蘭（Cattleya hybrida）因其花大形美、色彩豐富艷麗被世界公認(rèn)為“洋蘭之王”，經(jīng)長期傳統(tǒng)育種，已形成紫紅色系、橙紅色系及磚紅色系、淺色及粉色系、白色系、白花紅（紫）唇及白底五劍花、藍(lán)色系、黃色系、綠色系等八大色系[17]。目前通過雜交育種手段很難定向培育出新型花色，利用基因工程技術(shù)增強(qiáng)或抑制基因的表達(dá)從而改變花朵顏色已被廣泛利用到花卉基因工程育種中，但卡特蘭花色分子研究機(jī)理的缺乏影響了其花色新品種的進(jìn)程。本研究選擇紫色卡特蘭品種‘粉女郎為試材，利用RT-PCR和RACE技術(shù)分離克隆了ChCHS1和ChDFR1基因的cDNA全長，并對這2個基因在花朵開放進(jìn)程中的表達(dá)變化進(jìn)行分析，旨在為進(jìn)一步研究卡特蘭CHS及DFR基因功能，以及對未來通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新型花色的卡特蘭品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

卡特蘭‘粉女郎（Cattleya Acker's Spotlght ‘Pink lady）種植于中國林業(yè)科學(xué)研究院國家重點(diǎn)實(shí)驗室智能溫室。選取5個不同發(fā)育階段（圖1）的花瓣，P1（花芽1.5 cm長）、P2（花芽2.5 cm長）、P3（花芽4 cm長）、P4（花芽5 cm長，即將開放）、P5（盛開期），取后立將材料用液氮速凍，于-80 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈的合成 總RNA提取按照天根生化科技有限公司RNA prep Pure Plant Kit試劑盒說明書進(jìn)行，取1 μg RNA，分別使用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行RT-PCR、RACE-PCR。

1.2.2 CHS及DFR基因的克隆 （1）中間同源片段擴(kuò)增。在NCBI上搜索蘭科CHS、DFR基因，比對金釵石斛（Dendrobium nobile）、白葦蘭（Bromheadia finlaysoniana）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid cultivar）、蕙蘭雜交種（Cymbidium hybrid cultivar）、文心蘭（Oncidium Gower Ramsey）等CHS、DFR基因的mRNA序列，根據(jù)基因保守區(qū)分別設(shè)計中間片段的一對簡并引物CHS-F： 5′-AT（C/A）（T/A）C（T/C）CA（C/T）CT（A/C）ATCTTCTGCAC（C/G）AC-3′，CHS-R： 5′-AT（A/G）TT（C/G/A）CC（A/G）TACTC（C/T）GC（A/C）AGCAC-3′；DFR-F： 5′-C（T/G/C）GCAGGAACAGT（A/G/C）AA（C/T）GTGGA（A/G）GA-3′，DFR-R： 5′-GAGGAATG（G/T）CATA（T/C）GTG（G/A）（G/C）ATATCT-3′。以蕾期P3期中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR條件為94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將PCR產(chǎn)物以1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分析，并用AxyPrep DNA凝膠回收與預(yù)期片段大小一致的條帶，將目的片段與載體pMD 19-T vector（TaKaRa）進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10（TIANGEN），在涂有X-gal/IPTG平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色菌落，委托上海生物工程服務(wù)有限公司測序。

（2）CHS和DFR基因3′RACE及5′RACE擴(kuò)增。依據(jù)所得到的中間序列，分別設(shè)計CHS及DFR 5′端下游引物與CHS及DFR 3′端上游引物。CHS基因3′RACE引物：5′-CGTCTCGGCTTCCCAAACCA

TCCT-3′；DFR基因3′RACE引物：5′-CCCGAAGCA

AACGGCAGATACATT-3′；CHS基因：5′RACE引物5′-GGTAGAGCATTATGCGGTTGACGGAC-3′；DFR基因5′RACE引物：5′-GCTGCTTGGTGTTCCTCCA

CATTGAC-3′。以SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增，將與預(yù)期片段大小一致的PCR產(chǎn)物回收后連接到pMD 19-T載體上，委托上海生物工程服務(wù)有限公司測序。

1.2.3 基因序列分析 將測序所得的CHS及DFR基因不同片段分別用Contig Express軟件進(jìn)行拼接，并將獲得的cDNA全長通過ORF Finder軟件進(jìn)行開放閱讀框分析。用ProtParam軟件分析ChCHS1及ChDFR1蛋白的基本性質(zhì)（分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)）；使用BioEdit軟件對搜索得到的蛋白序列進(jìn)行多重比對，最后使用MEGA6.0軟件中的Neighbor-joining法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，并用Bootstrap進(jìn)行檢測。

1.2.4 實(shí)時熒光定量表達(dá)分析 提取卡特蘭5個發(fā)育階段的花瓣總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到不同時期的cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq II（TaKaRa）為熒光染料，以卡特蘭中分離得到的Actin基因為內(nèi)參，在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System熒光定量儀上進(jìn)行時期特異性表達(dá)的RT-PCR分析。反應(yīng)體系參照SYBR Premix Ex TaqTM II kit （TaKaRa）說明書。PCR條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。Actin基因的上游引物為：5′-ACTGGT

ATTGTGCTGGATTCTGG-3′；下游引物為：5′-ACG

CTCTGCGGTAGTTGTGAA-3′。CHS基因的上游引物：5′-TCGGCTTCCCAAACCATCCT-3′，下游引物為：5′-TCCAATCCTGAATGCCGAGC-3′；DFR基因的上游引物為：5′-CCGAAATGCCACCGAGTTTG

G-3′；下游引物：5′-GCTTCGGGATGCTCAAATAG

AA-3′。檢測目的基因和管家基因的CT值，每個樣品3次PCR重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用7500 software（ver. 2.0.1）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，使用Excel 2007分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ChCHS1及ChDFR1基因cDNA全長的獲得

以‘Pink lady蕾期P3期 cDNA為模板，通過RT-PCR分別得到一條與預(yù)期片段大小一致的擴(kuò)增片段（圖2-A，D）。將測序結(jié)果用Blastn分析，2片段分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中蘭科植物的CHS和DFR基因有較高的相似性。隨后，采用RACE法分別獲得長681 bp和 562 bp的CHS基因末端序列（圖2-B，C）， 以及長465 bp 和435 bp的DFR基因末端序列（圖2-E，F(xiàn)），最后通過序列拼接得到2個基因的cDNA全長，在NCBI的ORF Finder 平臺上分析發(fā)現(xiàn)，CHS全長1 508 bp，包含一個長度為1 185 bp的開放閱讀框，該基因的cDNA序列在80 bp處有起始密碼子ATG，在1 186 bp處有終止密碼子TGA，在1 478 bp處有polyA附加信號，將其命名為ChCHS1，登錄號為KP171693；DFR全長1 250 bp，其cDNA序列包含長度82 bp的5′非翻譯區(qū)和841 bp的3′非翻譯區(qū)，在1 239 bp處有polyA附加信號，將其命名為ChDFR1，登錄號為KP17694。

2.2 ChCHS1及ChDFR1基因的氨基酸序列分析

ChCHS1基因編碼一個包含394個氨基酸的蛋白質(zhì)，用ProtParam軟件預(yù)測所編碼蛋白質(zhì)的分子量為42.92 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為5.76。

利用NCBI中的BlastP對CHS編碼的蛋白保守域進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，CHS編碼的蛋白含有普遍CHS蛋白共有的2個保守域：cd00831（CHS_like， Chalcone and stilbene synthases， type III plant-specific polyketide synthases， III型聚酮合酶）和PLN03172（chalcone synthase family protein， 查爾酮合成酶）。

功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)[18-19]（圖3），ChCHS1含有多個在查爾酮合酶中起必要功能的活性位點(diǎn)，其中查爾酮合酶所特有的高度保守三聯(lián)催化位點(diǎn)Cys（C）、His（H）和Asn（N），分別在第165、304、337處；以及7個袋狀環(huán)化位點(diǎn)，即Thr（T）、Met（M）、2個Phe（F）、Ile（I）、Gly（G）和Pro（P），分別位于CHS蛋白序列的第133、138、216、266、255、257、376處；5個袋狀香豆酰結(jié)合位點(diǎn)：2個Ser（S）、Glu（E）、2個Thr（T），分別位于第134和339處、第193處、第195和198處；以及輔酶A結(jié)合位點(diǎn)Lys（K）（第56、63處）和Arg（R）（第59處）。在CHS基因中這些位點(diǎn)高度保守，且各位點(diǎn)相對位置大體保持不變。在（http：//prosite.expasy.org/）網(wǎng)站上分析發(fā)現(xiàn)，CHS還具有查爾酮合酶家族的特征多肽序列：RIMLYQQGCFAGGTVLR。

ChDFR1基因編碼一個包含350個氨基酸的蛋白，預(yù)測的分子量為39.35 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為5.57。在NCBI Conserved domains on檢索發(fā)現(xiàn)，卡特蘭ChDFR1編碼的氨基酸序列包含PLN02650（Dihydrofl-avanol4-reductase， DFR）中多個保守域，屬于SDR超家族（cl21454）。其功能位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，DFR中存在一個與NADPH結(jié)合的保守基序（V11-Y34）且含有26個氨基酸組成的底物特異結(jié)合保守基序（T135-K160）；N134氨基酸是決定還原DHK活性的特異天冬酰胺位點(diǎn)（圖4）。

通過BlastP軟件與相近物種比對檢索發(fā)現(xiàn)，卡特蘭ChCHS1氨基酸序列與金釵石斛Dendrobium nobile（ABE77392）、白葦蘭Bromheadia finlaysoniana（AAB62876）、蕙蘭雜交種Cymbidium hybrid cultivar（AIM58717）、小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris（AIS35912）高度同源，同源性分別達(dá)到96%、94%、94%、92%；與姜黃Curcuma longa（AEU17693）、油點(diǎn)草Tricyritis hirta（BAH16615）、葡萄Vitis vinifera（BAB84112）、美麗百合Lilium speciosum（BAE79201）、福斯特郁金香Tulipa fosteriana（AGJ50587）、銀白楊Populus alba（ABC86919）、牡丹Paeonia suffruticosa（AIU98510）有較高的同源性，分別為85%、85%、85%、84%、84%、82%、82%。利用BioEdit軟件將卡特蘭ChCHS1與其他11個物種的CHS蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對，結(jié)果見圖5。

卡特蘭ChDFR1基因編碼的氨基酸序列與白葦蘭Bromheadia finlaysoniana（AAB62873）、細(xì)莖石斛Dendrobium moniliforme（AEB96144）、文心蘭雜交種Oncidium hybrid cultivar（AAY32602）、蕙蘭雜交種Cymbidium hybrid cultivar（AAC17843）、朵麗蝶蘭× Doritaenopsis hybrid cultivar（AHA36975）、小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsis equestris（AIS35914）同源性較高，分別為88%、86%、84%、84%、82%、82%；與葡萄風(fēng)信子Muscari armeniacum（AIC33028）、淫羊藿Epimedium sagittatum（AFU90826）、普通小麥Triticum aestivum（BAD11018）、姜荷花Curcuma alismatifolia（ADK62520）也有較高的同源性，分別達(dá)到71%、71%、70%、68%。利用BioEdit軟件將卡特蘭ChDFR1與其他10個物種的DFR蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對（圖6）。

基于不同植物的CHS基因的氨基酸序列，用Mega 6.06軟件構(gòu)建了ChCHS1蛋白的分子系統(tǒng)樹，如圖7所示，卡特蘭ChCHS1與同科中的蕙蘭雜交種、蘭花、小蘭嶼蝴蝶蘭、蝴蝶蘭關(guān)系最近，分為同一分支；與石斛、細(xì)莖石斛、文心蘭同屬一大簇；在同科中與文心蘭關(guān)系較遠(yuǎn)。相比之下，與單子葉植物中的凹唇姜、姜黃、油點(diǎn)草、美麗百合、福斯特郁金香親緣關(guān)系較近，與其他雙子葉植物關(guān)系較遠(yuǎn)。

為進(jìn)一步了解ChDFR1基因的進(jìn)化關(guān)系，選擇已知植物的DFR氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明（圖8），卡特蘭與石斛蘭雜交種親緣關(guān)系最近，聚為同一小分支，在同科中與朵麗蝶蘭、小蘭嶼蝴蝶蘭、白葦蘭、文心蘭、蕙蘭親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；相比之下，與福斯特郁金香、美麗百合、洋蔥、旱花百子蓮、葡萄風(fēng)信子、風(fēng)信子、姜荷花關(guān)系較近，同屬一大簇；與長穗薄冰草、普通小麥、擬山羊草、玉米、淫羊藿、牡丹關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于兩大簇。

2.3 ChCHS1及ChDFR1基因的表達(dá)特性

對ChCHS1及ChDFR1基因在花朵開放過程中的表達(dá)模式進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩者在花序早期發(fā)育時表達(dá)量均極低，隨著花發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量呈上升趨勢。ChDFR1基因在花蕾即將開放時表達(dá)量達(dá)到最大，在盛開期表達(dá)量略有下降。而ChCHS1基因的表達(dá)在花蕾發(fā)育進(jìn)程中一直呈現(xiàn)明顯上升趨勢，直至盛開時達(dá)到最高。另外，對ChCHS1與ChDFR1基因表達(dá)量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，前3期ChCHS1與ChDFR1基因表達(dá)量基本相同，而在花蕾即將開放時及盛開期ChCHS1基因的表達(dá)量明顯高于ChDFR1基因（圖9）。

3 討論與結(jié)論

本研究通過RT-PCR和RACE方法從卡特蘭花瓣中成功分離出CHS和DFR兩個類黃酮代謝途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行同源克隆?；蛐蛄屑鞍被嵝蛄斜葘Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，這2個基因的編碼區(qū)與目前已知的相應(yīng)基因的氨基酸序列都有很高的同源性，在不同科植物間核苷酸水平上的同源性超過70%；在氨基酸水平上ChCHS1基因編碼氨基酸的同源性超過80%，ChDFR1基因編碼氨基酸同源性超過70%，這表明本次試驗克隆結(jié)果可靠，ChCHS1與ChDFR1分別屬于其基因家族的一員。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，這2個基因的進(jìn)化具有較明顯的種屬特性，分別與百合科、姜科親緣關(guān)系近；在同科之間的進(jìn)化關(guān)系不太一致，在ChCHS1基因的進(jìn)化進(jìn)程中，文心蘭與卡特蘭關(guān)系較遠(yuǎn)，而文心蘭ChDFR1基因與卡特蘭關(guān)系較近；但卡特蘭ChCHS1和ChDFR1基因都與蕙蘭和石斛蘭關(guān)系較近。Rasika[20]克隆了石斛蘭（Dendrobium Jaquelyn Thomas）的DFR基因并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其親緣關(guān)系與白葦蘭、蕙蘭、百合關(guān)系較近，與本試驗結(jié)果相似。

Mudalige-Jayawickrama等[21]用Northern blot方法對CHS和DFR基因在石斛蘭花器官開放進(jìn)程中不同時期的表達(dá)差異進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因在中等蕾期時表達(dá)量最高，在開放期時幾乎無法檢測到其表達(dá)。Hieber等[22]發(fā)現(xiàn)，DFR基因的表達(dá)貫穿文心蘭花朵發(fā)育整個進(jìn)程，無論在蕾期還是開放期，其表達(dá)水平一直為上調(diào)。而在白葦蘭中[11]，DFR基因的表達(dá)僅在幼嫩葉片中，在花器官中表達(dá)量很低。Pitakdantham等[23]在2種紫色石斛蘭的開花進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)，DFR基因花蕾接近開放時表達(dá)量高，在最小蕾期和盛開期不表達(dá)。Ying-ying等[24]從蝴蝶蘭中分離了5個CHS家族基因，這5個CHS基因都在蕾期及開放期有表達(dá)，在盛開期時不表達(dá)。本試驗通過相對實(shí)時熒光定量PCR的方法對CHS和DFR基因在卡特蘭開花不同時期中的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這2個基因在每個時期都有表達(dá)，但表達(dá)水平有明顯差異，ChCHS1基因隨著花朵開放及著色，其表達(dá)含量逐漸升高，在盛開期時達(dá)到頂峰；ChDFR1基因在即將開放時達(dá)到最高，在盛開期時表達(dá)量略有下降?？ㄌ靥mCHS及DFR基因在花色素合成過程中表達(dá)量的變化，說明這2個基因的表達(dá)與花青素的合成有關(guān)，推測CHS及DFR可能在轉(zhuǎn)錄水平上對卡特蘭花色的形成起到調(diào)控作用。

CHS和DFR基因分別為花色素苷生物合成途徑中上游和下游的第一關(guān)鍵酶。目前，通過基因工程技術(shù)，利用CHS和DFR基因改良花色的研究在矮牽牛、非洲菊、月季、康乃馨、三色堇等觀賞植物中均有報道，而具有豐富花色的蘭科植物雖然是研究花色的理想材料[25]，其分子育種卻明顯落后于其他觀賞植物[21，26-28]。本試驗成功分離了卡特蘭2個花色苷合成途徑中的關(guān)鍵基因，但如何在卡特蘭中利用CHS與DFR改良其花色仍需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Stephen Chandler， Yoshikazu Tanaka. Genetic Modification in Floriculture[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2007， 26： 169-197.

[2] Nishihara M， Nakatsuka T. Genetic engineering of flavonoid pigments to modify flower color in floricultureal plants[J]. Biotechnol Lett， 2011， 33： 433-441.

[3] Dixon R A， Steele C L. Flavonoids and isoflavonoids-a gold mine for metabolic engineering[J]. Trends Plant Sci， 1999， 4： 394-400.

[4] Holton T A， Cornish E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995， 7： 1 071-1 083.

[5] Mol J， Grotewold E， Koes R. How genes paint flowers and seeds[J]. Trends Plant Sci， 1998， 3： 212-217.

[6] Springob K， Nakajima J， Yamazaki M， et al. Recent advances in the biosynthesis and accumuation of anth-ocyanins[J]. Natural Products Report， 2003， 20： 288-303.

[7] Koes R， Verweij W， Quattrocchio F. Flavonoids： a colorful model for the regulation and evolution of biochemical pathways[J]. Trends Plant Sci， 2005， 10： 236-242.

[8] Reimold U， Kroeger M， Kreuzaler F， et al. Coding and 3'noncoding nucleotide sequence of chalcone synthase messenger RNA and assignment of amino acid sequence of the enzyme[J]. EMBO J， 1983， 2： 1 801-1 806.

[9] Holton T A， Brugllera F， Tanaka Y. Clong and expression of chalcone synthase from petunia hybrida[J]. Plant J， 1993， 4： 1 003-1 010.

[10] Sommer H， Saedler H. Structure of the chalcone synthase gene of Antirrhinummajus[J]. Mol Gen Genet， 1986， 202： 429-434.

[11] Liew C F， Goh C J， Loh C S， et al. Cloning and characterization of full-length cDNA clones encoding chalcone synthase from the orchid Bromheadia finlaysoniana[J]. Plant Physiol Biochem， 1998， 9： 647-655.

[12] 周興文， 李紀(jì)元， 范正琪. 金花茶查爾酮合成酶基因全長克隆與序列分析[J]. 生物技術(shù)通報， 2011， 6： 58-64.

[13] 周 琳， 王 雁， 彭鎮(zhèn)華. 牡丹查爾酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其組織特異性表達(dá)[J]. 園藝學(xué)報， 2010， 37（8）： 1 295-1 302.

[14] Meyer P， Heidmann I， Forkmann G. A new petunia flower colour generated by transformation of mutant with a maize gene[J]. Nature， 1987， 330： 677-688.

[15] Tanaka Y， Fukul Y， Fukuchi-Mizutani M， et al. Moclecular cloning and characterization of Rosa hybrida dihydroflavonol 4-reductase gene[J]. Plant Cell Physiol， 1995， 36（6）： 1 023-1 031.

[16] Holton T： Transgenic plants exhibiting altered flower colour and methods for producing the same[P]. PCT-International Patent Application NO. WO， 1996， 96/36716.

[17] 王 雁， 陳振皇， 鄭寶強(qiáng)， 等. 卡特蘭[M]. 北京： 中國林業(yè)出版社， 2012： 160-286.

[18] Ferrer J L， Jez J M， Bowman M E， et al. Structure of chalcone synthase and the molecular basis of plant polyketide biosynthesis[J]. Nat Struct Biol， 1999， 6（8）： 775-784.

[19] Michacl B， Austin Joseph P. The chalcone synthase superfamily of type III polyketide synthases[J]. Nat Struct Biol， 2003， 20（1）： 79-110.

[20] Mudalige R G. Dendrobium flower color： histology and genetic manipulation[D]. University of Hawaii， 2003.

[21] Mudalige R G， Kuehnle A R. Orchid biotechnology in production and improvement[J]. HortScience， 2004， 39： 11-17.

[22] Hieber A D， Mudalige-Jayawickrama R G， Kuehnle A R. Color genes in the orchid Oncidium Grower Ramsey： identification， expression， and potential genetic instability in an interspecific cross[J]. Planta， 2006， 223： 521-531.

[23] Pitakdantham W， Sutabutra T， Chiemsombat P. Isolation and characterization of dihydroflavonol 4-reductase gene in dendrobium flowers[J]. Journal of Plant Sciences， 2011， 6（2）： 88-94.

[24] Han Y Y， Ming F， Wang J W， et al. Molecular evolution and functional specialization of chalcone synthase superfamily from Phalaenopsis Orchid[J]. Genetica， 2006， 128： 429-438.

[25] Hao Yu， Chong Jin Goh. Molecular genetics of reproductive biology in orchids[J]. Plant Physiology， 2001， 127（4）： 1 390-1 393.

[26] Kuehnle A R， Lewis D H， Markham K R， et al. Floral flavonoids and pH in Dendrobium orchid species and hybrids[J]. Euphytica， 1997， 95： 187-194.

[27] Holton T A， Brugllera F， Tanaka Y. Cloning and expression of chlacone sythase from petunia hybrida[J]. Plant J， 1993， 4：1 003-1 010.

[28] Wen-Huei Chen， Chi-Yin Hsu， Hao-Yun Cheng， et al. Downregulation of putative UDP-glucose： flavonoid 3-O-glucosyltransferase gene alters flower coloring in Phalaenopsis[J]. Plant Cell Rep， 2011， 30： 1 007-1 017.