不同炮制方法對女貞子化學(xué)成分的影響

肖薇 黃健 陳志峰 郭桂明

摘要：目的 考察不同炮制方法對女貞子主要化學(xué)成分特女貞苷和齊墩果酸含量的影響。方法 用同一批次女貞子進(jìn)行炮制加工，采用反相高效液相色譜法，對女貞子生品、酒制女貞子、醋制女貞子和鹽制女貞子中的特女貞苷和齊墩果酸進(jìn)行含量測定。結(jié)果 女貞子生品及3種不同炮制品中特女貞苷含量依次為鹽制女貞子（1.997 5%）>女貞子生品（1.600 7%）>酒制女貞子（1.144 6%）>醋制女貞子（0.894 6%）。女貞子生品及3種不同炮制品中齊墩果酸含量依次為酒制女貞子（1.120 2%）>鹽制女貞子（0.924 6%）>醋制女貞子（0.913 2%）>女貞子生品（0.899 8%）。結(jié)論 女貞子不同炮制方法對其特女貞苷和齊墩果酸的含量有一定影響。

關(guān)鍵詞：女貞子；特女貞苷；齊墩果酸；炮制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.023

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0082-04

Effects of Different Methods of Preparation on the Contents of Chemical Components in Ligustri Lucidi Fructus XIAO Wei， HUANG Jan， CHEN Zhi-feng， GUO Gui-ming （Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Capital Medical University， Beijing 100010， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of different methods of preparation on the contents of nuzhenide and oleanolic acid in Ligustri Lucidi Fructus. Methods The same batch of Ligustri Lucidi Fructus was under preparation and process. RP-HPLC was used to determine the contents of nuzhenide and oleanolic acid in crude samples， wine-prepared samples， vinegar-prepared samples， and salt-prepared samples. Results The contents of nuzhenide were in the order as follow：salt-prepared samples （1.997 5%）>crude samples （1.600 7%）>wine-prepared samples （1.144 6%）>vinegar-prepared samples （0.894 6%）. The contents of oleanolic acid were in the order as follow：wine-prepared samples （1.120 2%）>salt-prepared samples （0.924 6%）>vinegar-prepared samples （0.913 2%）>crude samples （0.899 8%）. Conclusion Different methods of preparation have certain effects on the contents of nuzhenide and oleanolic acid in Ligustri Lucidi Fructus.

Key words：Ligustri Lucidi Fructus；nuzhenide；oleanolic acid；method of preparation

基金項目：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院級課題（2013-26）

通訊作者：郭桂明，E-mail：ggmjq@sina.com

[2] De Feudis FV. A brief history of EGb 761? and its therapeutic uses[J]. Pharmacopsychiatry，2003，36（S1）：2-7.

[3] Mahadevan S， Park Y. Multifaceted therapeutic benefits of Ginkgo biloba L.：chemistry， efficacy， safety， and uses[J]. Journal of Food Science，2008，73（1）：R14-R19.

[4] Li L， Zhao Y， Du F， et al. Intestinal absorption and presystemic elimination of various chemical constituents present in GBE50 extract， a standardized extract of Ginkgo biloba leaves[J]. Current Drug Metabolism，2012，13（5）：494-509.

[5] Masaki K， Hashimoto M， Imai T. Intestinal first-pass metabolism via carboxylesterase in rat jejunum and ileum[J]. Drug metabolism and disposition，2007，35（7）：1089-1095.

[6] Agar WT， Hird FJR， Sidhu GS. The absorption， transfer and uptake of amino acids by intestinal tissue[J]. Biochimica et Biophysica Acta，1956，22（1）：21-30.

[7] Lv H， Wang G， Wu X， et al. Transport characteristics of ginkgolide B by Caco-2 cells and examination of ginkgolide B oral absorption potential using rat in situ intestinal loop method[J]. International Journal of Pharmaceutics，2008，351（1）：31-35.

[8] Luo Z， Liu Y， Zhao B， et al. Ex vivo and in situ approaches used to study intestinal absorption[J]. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods，2013，68（2）：208-216.

（收稿日期：2014-12-10）

（修回日期：2015-01-05；編輯：陳靜）

女貞子為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實，性涼，味甘、苦，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效。女貞子歷代炮制方法較多，如宋代有“飯上蒸”（《瘡瘍經(jīng)驗全書》），明代有用復(fù)合輔料酒、墨旱蓮草及地黃制（《本草蒙筌》）、酒浸蒸曬（《本草通玄》）、酒拌黑豆蒸九次（《炮炙大法》）、酒拌蒸（《先醒齋廣筆記》）、酒蜜拌蒸（《審視瑤函》）等方法，并有“浸酒去風(fēng)補(bǔ)血”的論述（《本草品匯精要》），清代又增加了蜜酒拌蒸（《醫(yī)方集解》）、鹽水拌炒（《得配本草》）、白芥子車前水浸（《本草綱目拾遺》）等[1]。現(xiàn)代主要炮制方法以酒蒸和酒燉法應(yīng)用居多[2]，不同炮制方法功效各異。

現(xiàn)代研究表明，女貞子主要含有萜類、黃酮類、苯乙醇苷類、揮發(fā)油、磷脂、多糖、脂肪酸、氨基酸、微量元素等化學(xué)成分，主要有保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抗衰老等藥理作用[3]，2010年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）以特女貞苷（C31H42O17）為質(zhì)量控制指標(biāo)[4]。2005年版《中國藥典》以齊墩果酸為質(zhì)量控制指標(biāo)[5]。本研究采用高效液相色譜法（HPLC），比較醋制、酒制、鹽制3種炮制方法對女貞子中特女貞苷和齊墩果酸含量的影響。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（Agilent G1311A 四元泵，Agilent G1329A自動進(jìn)樣器，Agilent G1315D DAD檢測器）；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm， 150 mm×4.6 mm）；AL204型電子天平，METTLER TOLEDO；粉碎機(jī)RT-02B，臺灣榮聰。

特女貞苷、齊墩果酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院（供含量測定用，批號分別為111926- 201203、110709-201206），乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。女貞子樣品（北京杏林藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號140217），經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部主任藥師郭桂明主任鑒定為木犀科植物女貞Ligustrum lucidum Ait.的干燥成熟果實。

2 方法與結(jié)果

2.1 炮制方法

依據(jù)《北京市中藥飲片炮制規(guī)范（2008年版）》[6]制備3種女貞子炮制品。醋制女貞子、酒制女貞子：稱取100 g女貞子生品2份，分別放入陶瓷鍋；精確量取20 mL米醋和20 mL黃酒，分別傾入2份女貞子樣品中，拌勻，蓋上鍋蓋，悶潤3 h；保持陶瓷鍋密閉，放入不銹鋼蒸鍋，蒸21 h。鹽制女貞子：稱取100 g女貞子生品1份，放入陶瓷鍋；噴淋1%鹽水20 mL，拌勻，悶潤3 h；保持陶瓷鍋密閉，放入不銹鋼蒸鍋，蒸1 h。

2.2 特女貞苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（40∶60）；流速：1 mL/min；測定波長：224 nm；柱溫為室溫。理論板數(shù)按特女貞苷峰計算應(yīng)不低于4000。

2.2.2 對照品溶液的制備 取特女貞苷對照品10.45 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.007 4 mg/mL對照品儲備液（以96.4%計）。精密吸取對照品儲備液2.5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得0.251 9 mg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取藥材粉末約0.5 g（過3號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取特女貞苷對照品13 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶液并稀釋至刻度，搖勻，得到0.250 6 mg/mL對照品儲備液（以96.4%計）。精密吸取對照品儲備液1、2、3、5、8、10、20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=1127.2X+69.56（r2=0.999 7）。結(jié)果表明，特女貞苷在0.250 6～5.012 μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，RSD=0.67%（n=6），表明精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h測定峰面積，RSD=1.02%（n=6）。結(jié)果表明，本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品6份，分別按“2.2.3”項下方法制成供試品溶液，測定含量。測得平均含量為0.899 6%，RSD=0.28%（n=6）。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取5份已測含量（0.899 6%）的醋制女貞子粉0.1 g，加入0.250 6 mg/mL對照品儲備液4 mL，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定特女貞苷含量，分別計算回收率。結(jié)果特女貞苷平均回收率為100.52%，RSD=1.70% （n=5），見表1。

2.2.9 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件測定，對照品平均峰面積為1631.47，樣品含量按干燥品計算，結(jié)果見圖1、表2。

表1 醋制女貞子中特女貞苷加樣回收率試驗（n=5）

取樣量

（g） 樣品中

含量（mg） 加入量

（mg） 測得量

（mg） 回收率

（%） 平均回收

率（%） RSD

（%）

0.102 5 0.922 3 1.002 4 1.949 9 102.51

0.099 8 0.897 9 1.002 4 1.906 3 100.60

0.098 9 0.890 3 1.002 4 1.875 7 98.30 100.52 1.70

0.101 3 0.911 7 1.002 4 1.931 8 101.77

0.097 3 0.897 1 1.002 4 1.893 7 99.42

對照品 女貞子生品

醋制女貞子 酒制女貞子

鹽制女貞子

圖1 特女貞子含量測定HPLC圖

表2 特女貞苷含量測定結(jié)果（n=4）

樣品 取樣量（g） 對照品峰面積 樣品平均峰面積 含量（%）

女貞子生品 0.499 6 1631.47 2071.72 1.600 7

醋制女貞子 0.503 1 1631.47 1165.98 0.894 6

酒制女貞子 0.500 6 1631.47 1484.47 1.144 6

鹽制女貞子 0.501 4 1631.47 2594.61 1.997 5

2.3 齊墩果酸含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21）；流速：1 mL/min；測定波長：210 nm；柱溫為室溫。理論板數(shù)按齊墩果酸峰計算應(yīng)不低于5000。

2.3.2 對照品溶液的制備 取齊墩果酸對照品20.2 mg，置20 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.958 5 mg/mL對照品儲備液（以94.90%計）。精密吸取對照品儲備液1 mL，置20 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得到47.92 μg/mL對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品粗粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，稱定質(zhì)量，加乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品儲備液（0.958 5 mg/mL）0.2、0.5、1、5、10、20 μL，按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=691.2X-45.791（r2=0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，齊墩果酸進(jìn)樣量在0.202～2.02 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得峰面積，RSD=1.41%（n=6），表明精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、4、8、12、16、24 h測定峰面積，RSD=1.62%（n=5）。結(jié)果表明，本品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一樣品6份，分別按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，測定含量，平均含量為0.967 7%，RSD=1.30%（n=5）。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取5份已測含量（0.967 7%）的醋制女貞子粉0.1 g，加入0.958 5 mg/mL對照品儲備液1 mL，按“2.3.3”項下方法制成供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定齊墩果酸的含量，分別計算回收率。結(jié)果特女貞苷的平均回收率為100.37%，RSD=1.16%（n=5），見表3。

表3 醋制女貞子中齊墩果酸加樣回收率試驗結(jié)果（n=5）

取樣量

（g） 樣品中

含量（mg） 加入量

（mg） 測得量

（mg） 回收率

（%） 平均回收

率（%） RSD

（%）

0.100 4 0.971 6 0.958 5 1.945 0 100.77

0.101 7 0.984 2 0.958 5 1.976 9 101.76

0.099 3 0.960 9 0.958 5 1.920 0 100.03 100.37 1.16

0.098 9 0.957 0 0.958 5 1.888 7 98.60

0.101 2 0.979 3 0.958 5 1.951 2 100.69

2.3.9 樣品測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定，對照品平均峰面積為332.28，樣品含量按干燥品計算，結(jié)果見圖2、表4。

對照品 女貞子生品

醋制女貞子 鹽制女貞子

酒制女貞子

圖2 齊墩果酸含量測定HPLC圖

表4 齊墩果酸含量測定結(jié)果（n=4）

樣品 取樣量（g） 對照品峰面積 樣品平均峰面積 含量（%）

女貞子生品 1.003 4 332.28 1252.13 0.899 8

醋制女貞子 1.021 2 332.28 1293.32 0.913 2

酒制女貞子 1.001 9 332.28 1556.42 1.120 2

鹽制女貞子 1.182 3 332.28 1516.03 0.924 6

3 討論

本研究選用女貞子藥材中萜類水溶性成分特女貞苷和萜類脂溶性成分齊墩果酸作為指標(biāo)成分。特女貞苷為2010年版《中國藥典》（一部）女貞子含量測定的特異性指標(biāo)成分。齊墩果酸為女貞子的主要有效成分，具有保肝、強(qiáng)心、降脂、降血糖、抗炎等藥理作用，近年對其研究較為深入和廣泛[3]。

特女貞苷的含量測定參照2010年版《中國藥典》（一部）方法[4]，測定結(jié)果為鹽制女貞子（1.997 5%）>女貞子生品（1.600 7%）>酒制女貞子（1.144 6%）>醋制女貞子（0.894 6%）。分析其原因，酒制、醋制的炮制方法加熱時間較長，而特女貞苷隨著燉制時間的延長含量呈逐漸降低的趨勢[7]，環(huán)烯醚萜苷類性質(zhì)不穩(wěn)定，加水、加熱可使其水解生成次級苷紅景天苷。鹽制的炮制方法引藥入腎經(jīng)，鹽制女貞子中特女貞苷含量較高是否與藥物歸經(jīng)有關(guān)還需進(jìn)一步研究。

齊墩果酸的含量測定參照2005年版《中國藥典》（一部）[5]和文獻(xiàn)[8-9]中齊墩果酸的測定方法和條件。流動相采用乙腈-甲醇-0.5%醋酸銨溶液（67∶12∶21），其中加入適當(dāng)?shù)乃釅A調(diào)節(jié)劑有助于齊墩果酸的分離[8]，但該流動相并未將齊墩果酸和熊果酸進(jìn)行有效的基線分離。此外，齊墩果酸為三萜類脂溶性成分，所以女貞子酒制炮制品中齊墩果酸的含量明顯高于其他炮制品及生品。

參考文獻(xiàn)：

[1] 龔千峰.中藥炮制學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：294-295.

[2] 徐蘋，張學(xué)蘭.女貞子炮制歷史沿革研究[J].山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報， 2008，32（3）：263-264.

[3] 劉婷婷，王萌.女貞子化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20（14）：228-234.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：43.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：31.

[6] 北京市藥品監(jiān)督管理局.北京市中藥飲片炮制規(guī)范：2008年版[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：31.

[7] 張學(xué)蘭，侯杰，李慧芬，等.炮制對女貞子中特女貞苷含量的影響[J].中藥材，2009，32（4）：498-500.

[8] 游勇基，張桂鳳.高效液相色譜法測定中藥制劑中齊墩果酸的含量[J].海峽藥學(xué)，2009，21（7）：67-69.

[9] 張麗，陳汀，曹雨誕，等.女貞子不同炮制品及不同樹齡中齊墩果酸和熊果酸含量研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（1）：46-48.

（收稿日期：2014-11-05）

（修回日期：2015-02-06；編輯：陳靜）