苦杏仁苷對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠腫瘤壞死因子—α和細(xì)胞間黏附分子—1的影響

羅德梅 單志桂 葛金蓮 劉青 羅莉

摘要：目的 探討苦杏仁苷對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠的抗炎作用機(jī)制。方法 Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、苦杏仁苷組、雷公藤多苷組。采用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)建立CIA大鼠模型，造模后第15日，各給藥組予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)28 d。ELISA檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子-1（sICAM-1）水平，免疫組化法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜TNF-α表達(dá)。結(jié)果 苦杏仁苷組和雷公藤多苷組關(guān)節(jié)滑膜TNF-α陽性表達(dá)相似，較模型組明顯減少，且苦杏仁苷組和雷公藤多苷組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平與模型組比較均明顯下降（P<0.05），與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 苦杏仁苷通過有效抑制TNF-α、sICAM-1水平及TNF-α表達(dá)，達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。

關(guān)鍵詞：苦杏仁苷；Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎；腫瘤壞死因子-α；細(xì)胞間黏附分子-1；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.021

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）07-0075-03

Effects of Amygdalin on TNF-α and sICAM-1 of Rats with Type II Collagen-induced Arthritis LUO De-mei， SHAN Zhi-gui， GE Jin-lian， LIU Qing， LUO Li （The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China）

Abstract：Objective To discuss effects of anti-inflammatory mechanism of amygdalin on rats with type II collagen-induced arthritis （CIA）. Methods Wistar rats were randomized into normal group， model group， amygdalin group， and tripterygium group. Type II CIA rat models were established. From the 15th day after the modeling establishment， each administration group was given corresponding dose of medicine for continuous 28 days. Levels of TNF-α and sICAM-1 were detected by ELISA in serum of rats， and expression of TNF-α was detected by immuno- histochemical method. Results TNF-α positive expression in amygdalin group and tripterygium group was similar and significantly reduced compared with model group. Levels TNF-α and sICAM-1 in amygdalin group and tripterygium group significantly decreased compared with those in model group （P<0.05）， without significant difference compared with normal group （P>0.05）. Conclusion Amygdalin can inhibit the expression of TNF-α and levels of TNF-α and sICAM-1， in order to treat rheumatoid arthritis.

Key words：amygdalin；type II collagen-induced arthritis；TNF-α；sICAM-1；rats

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主要特征的自身免疫性疾病，其確切的病因和發(fā)病機(jī)理目前尚不明確。苦杏仁苷是苦杏仁中的有效成分，廣泛存在于薔薇科植物的種子中，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2014211C047）；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)專項(xiàng)基金（2012YX06）

通訊作者：羅莉，E-mail：luoli.6@163.com

抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等作用[1]。Hwang等[2]采用體外脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的細(xì)胞系和角叉菜膠誘導(dǎo)的踝關(guān)節(jié)炎大鼠模型研究顯示，苦杏仁苷對(duì)關(guān)節(jié)炎具有較好的消炎和鎮(zhèn)痛作用。本研究觀察苦杏仁苷對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（type Ⅱ collagen induced arthritis，CIA）大鼠干預(yù)后大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織病理、滑膜和血清中細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達(dá)及血清中細(xì)胞間黏附分子（sICAM-1）的變化，為臨床防治RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Wistar大鼠45只，7～8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)IACUC-20130319012。實(shí)驗(yàn)期間飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)研究部，SPF級(jí)常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 藥物

苦杏仁苷購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)MUST-13011801；雷公藤多苷片購(gòu)自于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司，批號(hào)20130105。

1.3 主要試劑與儀器

牛Ⅱ型膠原（CⅡ），Sigma公司；弗氏完全佐劑，Sigma公司；大鼠TNF-α、sICAM-1定量試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司；脫鈣液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α一抗體，武漢博士德生物工程有限公司；pV二步法免疫組化檢測(cè)試劑、PBS緩沖液、抗體稀釋液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。切片機(jī)，德國(guó)LEICA RM2135；光學(xué)顯微鏡，中國(guó)NIKON YS100；顯微照相機(jī)，德國(guó)LEICA DM3000；孵育溫箱，日本EYELA SLI-700；數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模與分組

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)選取8只為正常組，其余大鼠參照文獻(xiàn)[3]方法建立膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型（CIA）。將CⅡ溶于預(yù)冷的0.1 mol/L冰醋酸中，終濃度為4 mg/mL，4 ℃過夜。將溶解于冰醋酸CⅡ加入等體積的弗氏完全佐劑在冰浴條件下使二者充分乳化。于大鼠左足跖肉墊及尾根部多點(diǎn)皮內(nèi)注射CⅡ乳劑0.2 mL/只進(jìn)行初次免疫，7 d后，使用上述乳劑于足跖及尾根部再次加強(qiáng)免疫。造模14 d后參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行評(píng)估，于致炎第21日剔除未發(fā)病大鼠，將造模成功的35只大鼠隨機(jī)分為模型組5只、雷公藤多苷組10只及苦杏仁苷高、低劑量組各10只。

2.2 大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)定

初次免疫后每周對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分（arthritis index，AI），大鼠關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)以0～4分計(jì)算，分為5級(jí)。0分：無關(guān)節(jié)炎癥狀；1分：?jiǎn)蝹€(gè)爪或趾（指）的紅腫；2分：2個(gè)關(guān)節(jié)受累；3分：2個(gè)以上關(guān)節(jié)受累；4分：全部爪及趾均發(fā)生嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎。每只大鼠AI為4只包括趾（指）在內(nèi)的整個(gè)爪評(píng)分之和。初次免疫第14日后AI≥6分及以上的大鼠提示造模成功，用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 給藥及取材

雷公藤多苷組給藥劑量為1 mg/kg，苦杏仁苷組給藥劑量為120 mg/kg，臨用前分別用滅菌蒸餾水配制，給藥體積1 mL/100 g灌胃，正常組、模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4周。游標(biāo)卡尺記錄后足踝關(guān)節(jié)腫脹情況。給藥4周后大鼠稱重，10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，參照文獻(xiàn)[4]方法，股動(dòng)脈采血，分離血清，4%多聚甲醛固定分離膝關(guān)節(jié)滑膜作為病理及免疫組織化染色標(biāo)本。

2.4 組織病理學(xué)觀察

常規(guī)乙醇梯度脫水，進(jìn)行石蠟包埋?切片?HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察?

2.5 血清腫瘤壞死因子-α和細(xì)胞間黏附分子-1測(cè)定

ELISA檢測(cè)血清TNF-α、sICAM-1，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.6 免疫組化染色檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜中腫瘤壞死因子-α表達(dá)

切片脫水脫蠟、水化，PBS洗3次×5 min，滴加3%H2O2室溫10 min阻斷內(nèi)源酶，PBS洗3次×5 min， 0.01 mol/L檸檬酸鹽抗原修復(fù)液，微波修復(fù)10 min，室溫冷卻，蒸餾水、PBS依次洗1次，各 5 min，加一抗，4 ℃冰箱過夜。將濕盒置于室溫1 h，加二抗，37 ℃溫箱孵育25 min，PBS洗3次，每次5 min。新鮮配置的DAB顯色液進(jìn)行顯色，檢測(cè)滑膜中TNF-α表達(dá)?蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、返藍(lán)、脫水、透明、中性樹膠封片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 —x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 膝關(guān)節(jié)滑膜病理觀察結(jié)果

給藥28 d后，鏡下觀察可見正常組大鼠滑膜組織學(xué)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列清晰，未見增生，無明顯炎性細(xì)胞聚集浸潤(rùn)；模型組大鼠滑膜增厚明顯，排列紊亂，有新生血管生成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；苦杏仁苷組和雷公藤多苷組大鼠滑膜增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管生成較模型組明顯減輕。

4.2 苦杏仁苷對(duì)大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度的影響

與正常組比較，模型組大鼠關(guān)節(jié)明顯腫脹（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠第7、14、21、28日關(guān)節(jié)腫脹均減輕（P<0.05），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

4.3 苦杏仁苷對(duì)大鼠外周血中腫瘤壞死因子-α、細(xì)胞間黏附分子-1的影響

給藥28 d后，與模型組比較，苦杏仁苷組、雷公藤多苷組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平均明顯下降（P<0.05），與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平比較（—x±s，μg/L）

組別 只數(shù) sICAM-1 TNF-α

正常組 8 20.1±0.4 59.2±7.1

模型組 5 22.0±1.5 74.2±8.7

苦杏仁苷組 10 19.6±0.9# 59.3±7.7#

雷公藤多苷組 10 20.4±0.3# 60.2±8.6#

4.4 關(guān)節(jié)滑膜免疫組化染色觀察結(jié)果

給藥28 d后，免疫組化染色顯示，炎性細(xì)胞因子TNF-α陽性表達(dá)區(qū)域呈棕黃色。正常組大鼠關(guān)節(jié)滑膜中僅見極少量的TNF-α陽性表達(dá)；模型組大鼠關(guān)節(jié)滑膜可見TNF-α陽性表達(dá)明顯增多，各給藥組TNF-α陽性表達(dá)較模型組明顯減少。結(jié)果見圖1。

正常組 模型組 苦杏仁苷組 雷公藤多苷組

圖1 各組大鼠滑膜中TNF-α表達(dá)（免疫組化染色，×400）

5 討論

RA屬中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，目前，研究RA模型包括佐劑性關(guān)節(jié)炎模型（ajudvant arthritis，AA）和CIA。AA制作方便簡(jiǎn)單，可廣泛應(yīng)用于多種動(dòng)物，但它與RA差異較大，病變具有自限性。CIA大鼠模型是Trentham等[5]于1977年首次建立，現(xiàn)已公認(rèn)為是研究RA的經(jīng)典模型。

TNF-α是RA中重要炎性細(xì)胞因子，TNF-α可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖，促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞凋亡，引起炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生并逐漸出現(xiàn)骨侵蝕；ICAM-1是一類黏附分子，為淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-1的配體，通過介導(dǎo)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)

間的黏附作用，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。雷公藤因具有抗炎、免疫抑制等作用，目前已被用于治療RA等多種自身免疫性疾病，并取得肯定療效，但有一定的不良反應(yīng)。有文獻(xiàn)報(bào)道，苦杏仁苷對(duì)AA能夠抑制炎癥，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用，苦杏仁水煎劑對(duì)AA大鼠具有軟骨組織破壞減輕，組織學(xué)上有明顯改善炎癥程度作用[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠滑膜組織病理切片在模型組顯示滑膜增厚明顯，排列紊亂，有新生血管生成，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；給藥組大鼠滑膜增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管生成較模型組明顯減輕。另外，給藥組大鼠外周血中TNF-α、sICAM-1水平與模型組比較均明顯下降，且給藥組TNF-α陽性表達(dá)相似，較模型組明顯減少，提示苦杏仁苷通過抑制TNF-α及sICAM-1的表達(dá)，有效抑制CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹，減輕病理損傷，進(jìn)而達(dá)到抗RA的作用，且療效與雷公藤多苷相似，可為RA的中醫(yī)治療用藥及中醫(yī)免疫學(xué)研究提供一定的啟示。

參考文獻(xiàn)：

[1] Deng JG， Wang HL， Liu YD， et a1. Anti-atherosclerotic effects mediated by the combination of probucol and amygdalin in apolipoprotein e-knockout mice fed with a high fat diet[J]. J An Vet Adv，2012，11（1）：20-25.

[2] Hwang H， Lee H， Kim C， et al. Inhibitory effect of amygdalin on lipopolysaccharide-inducible TNF-α and IL-1β mRNA expression and carrageenan-induced rat arthritis[J]. Journal of Micro-biology and Biotechnology，2008，18（10）：1641-1647.

[3] 李寶麗，唐方，龐曉東.Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型制備[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2006，22（5）：350-352.

[4] 石磊，李小峰，王彩虹，等.大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型的制備及評(píng)價(jià)[J].臨床醫(yī)藥實(shí)踐，2011，20（4）：245-247.

[5] Trentham DE， Townes AS， Kang AH. Autoimmunity to type Ⅱ collagen：an experimental model of arthritis[J]. J Exp Med， 1977，146：857-868.

[6] 方偉蓉，李運(yùn)曼，鐘林霖.苦杏仁苷對(duì)佐劑性炎癥影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)雜志，2004，9（30）：289-293.

（收稿日期：2014-12-17；編輯：華強(qiáng)）