基于文獻挖掘的中醫(yī)證候生物學基礎初步研究

劉婧瑋 翟興 馮玄超 高闊 趙慧輝 陳坤 劉甲 陳建新

摘要：目的 以中醫(yī)常見證型氣虛證為切入點，從生物分子網(wǎng)絡角度探索中醫(yī)證候生物學基礎。方法 建立神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）相關基因數(shù)據(jù)字典及氣虛證表征術語詞庫，并通過Genclip軟件檢索氣虛證表征文獻并挖掘氣虛證特征性NEI基因，探索證候的生物活性物質(zhì)。結(jié)果 對挖掘出的基因數(shù)據(jù)進行分析顯示，“氣虛證”相關基因與內(nèi)分泌、細胞信號傳導、造血細胞系、免疫缺陷等相關。中醫(yī)證型的內(nèi)在生物學特征可以在NEI水平上進行有效的辨識。結(jié)論 文獻挖掘作為一種新的發(fā)現(xiàn)證候生物學指標的方法具有一定的可行性，建議將其擴大到其他證型的研究中，驗證該方法的普適性和可靠性。

關鍵詞：中醫(yī)證候；氣虛證；文獻挖掘；生物學基礎；神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.013

中圖分類號：R2-05 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0043-04

中醫(yī)學的基本特點在于整體觀和辨證論治，以病證結(jié)合、方證相應，即“病證方”結(jié)合的診療模式為特色。證（證候）的生物學基礎則是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關鍵，目前研究較多的有血瘀證、腎陽虛證、寒證、熱證等，并形成了證本質(zhì)研究、證實質(zhì)研究、證候客觀化等多個學術生長點，如陰黃證和陽黃證的代謝組學發(fā)病機制[1]，為闡釋中醫(yī)證候的生物學本質(zhì)，證的診斷客觀化、規(guī)范化和病證分型治療提供依據(jù)。

基金項目：國家自然科學基金面上項目（81173463）；北京市青年英才計劃（YETP0821）

通訊作者：陳建新，E-mail：Cjx@bucm.edu.cn

氣虛證是中醫(yī)常見證型，可見于研究深入的幾大疾病中，如冠心病、心力衰竭、糖尿病等[2-7]，臨床常見檢驗方法已對上述疾病進行診斷。研究表明，這些常見病與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫（NEI）密切相關[8]。本研究以NEI網(wǎng)絡相關基因為基礎，以氣虛證為切入點，通過文獻挖掘方法初步得到了氣虛證基于NEI網(wǎng)絡特有的生物活性物質(zhì)，對闡明證候的客觀性，揭示證候、疾病中分子相互作用機制有著重要意義，為揭示證候的科學內(nèi)涵奠定了方法學基礎。

1 資料與方法

1.1 收集表征術語關鍵詞

以中華人民共和國國家標準《中醫(yī)臨床診療術語》為主要依據(jù)收集、整理出11個“氣虛證”的表征術語關鍵詞，包括氣虛、隱痛、鈍痛、氣短、乏力、神疲、懶言、頭暈、自汗、舌淡、脈虛。

1.2 文獻挖掘方法

從dbNEI（http：//166.111.130.62/portal/root/ bi_dbnei/download.jsp）數(shù)據(jù)庫上下載NEI相關基因（共2242個與NEI相關的基因），載入Genclip軟件中，然后使用該軟件的“Word related Gene Search”功能在文獻庫中挖掘與給定表征術語相關的NEI基因，并使用“Literature Mining Gene Networks”功能構(gòu)建氣虛證每個表征術語的基因網(wǎng)絡。分別比較挖掘出的與氣虛證各關鍵詞相關的基因，找出同時出現(xiàn)在2個關鍵詞及以上的那些基因，由于這些基因至少同時在某一證候的2種表征中出現(xiàn)，那么，他們就很可能與該證候有一定聯(lián)系而非只和單一表征有關，即與氣虛證有聯(lián)系。

1.3 基因分析方法

應用DAVID Bioinformatics Resources 6.7軟件[9]對所得基因進行分層聚類、基因類型測試和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析?；蚓垲悳y試是一種探索性的工具，用以探索檢測基因表達數(shù)據(jù)內(nèi)部的關聯(lián)性，為進一步考慮進行假設性的篩選。KEGG通路分析可以幫助尋找所提供基因所參與的生物過程。

2 結(jié)果

文獻挖掘結(jié)果顯示，氣虛的11個關鍵詞中有5個挖掘出與之相關的基因，具體關鍵詞及挖掘出的基因個數(shù)見表1；通過比較氣虛證與各個關鍵詞相關的基因，找出了15個同時出現(xiàn)在2個關鍵詞及以上的基因，見表2。脈虛、自汗、頭暈、氣虛關鍵詞基因網(wǎng)絡見圖1。

表1 氣虛證關鍵詞對應的基因數(shù)目

關鍵詞 基因個數(shù)

氣虛 21

呼吸困難 95

頭暈 63

脈虛 4

自汗 4

表2 同時出現(xiàn)在2個表征術語及以上的基因

編號 氣虛基因 出現(xiàn)次數(shù)

1 IL6（白細胞介素6） 4

2 IL10（白細胞介素10） 4

3 IL2（白細胞介素2） 3

4 IL1B（白細胞介素β） 3

續(xù)表2

編號 氣虛基因 出現(xiàn)次數(shù)

5 IFNG（干擾素γ） 3

6 POMC（阿黑皮素） 3

7 ADIPOQ（脂聯(lián)素） 3

8 IL8（白細胞介素8） 3

9 IL5（白細胞介素5） 2

10 CD14（細胞表面分化抗原14） 2

11 CD79A（細胞表面分化抗原79-α） 2

12 FGF2（成纖維細胞生長因子） 2

13 CD40LG（細胞表面分化抗原40配體） 2

14 NPPB（腦鈉肽） 2

15 LEP（人瘦素） 2

脈虛 自汗

氣虛

頭暈

圖1 氣虛證關鍵詞基因網(wǎng)絡

3 討論

1973年，Isakovi?[10]和Jankovi?[11]通過雙邊對稱電解損傷大鼠大腦不同部位（下丘腦、腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、丘腦、上丘、尾狀核和杏仁復合體），并觀察其對淋巴器官的影響后，首次提出了NEI三大系統(tǒng)之間的關系。NEI網(wǎng)絡學說的提出和發(fā)展，與幾千年來中醫(yī)理論提倡的整體觀念可謂不謀而合，并在一定程度上為來源于長期臨床實踐的中醫(yī)理論提供了現(xiàn)代醫(yī)學證據(jù)。1990年，高氏[12]和王氏[13]將NEI網(wǎng)絡與中醫(yī)理論相聯(lián)系，并引起了中醫(yī)界的廣泛關注。因此，我們認為借助NEI網(wǎng)絡，可以更好地理解中醫(yī)，進一步實現(xiàn)中醫(yī)的現(xiàn)代化與國際化。

網(wǎng)絡是復雜生物系統(tǒng)的表現(xiàn)方式，網(wǎng)絡的復雜性本質(zhì)上就是“關系”的復雜性。正是系統(tǒng)生物學以上研究模式與策略的變革與進步，使從生物分子網(wǎng)絡角度探索證候的生物學基礎具備了現(xiàn)實可行性。中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中，不少學者曾對NEI網(wǎng)絡、分子網(wǎng)絡調(diào)節(jié)和細胞因子網(wǎng)絡等問題進行了思考[14-16]，提示中醫(yī)藥現(xiàn)代研究需突破單生物學指標的局限，充分考慮機體內(nèi)部復雜的相互聯(lián)系，強調(diào)了中醫(yī)藥現(xiàn)代研究突破“還原論”的重要性。然而，由于“系統(tǒng)”相關的數(shù)據(jù)尚未完善，以及建模、仿真和分析等“計算”能力的缺乏，既往的“網(wǎng)絡”往往局限于現(xiàn)象描述，側(cè)重于理論與概念分析。近年來，“系統(tǒng)生物學”的新興，海量數(shù)據(jù)獲取技術（如“組學”），尤其是計算分析能力和系統(tǒng)建模等方法的迅速發(fā)展，給“生物網(wǎng)絡”賦予了豐富的、實質(zhì)性的內(nèi)涵，并迅速成為國際生命科學與醫(yī)學研究的新熱點。多學科專家開始致力于從海量數(shù)據(jù)中尋找實現(xiàn)生命功能或?qū)е录膊〉膬?nèi)在網(wǎng)絡系統(tǒng)，了解其時空變化及系統(tǒng)性質(zhì)，并發(fā)展控制措施。例如，2005年提出了“網(wǎng)絡生物學”[17]，同年《Cell》首次刊登了人類的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡[18]。系統(tǒng)生物學以建立可預測、可預防和個體化的新的醫(yī)學診療體系為目的[19]，其中基因表達調(diào)控網(wǎng)絡、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡、信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡及代謝網(wǎng)絡等生物網(wǎng)絡的研究則是理解“系統(tǒng)”的關鍵。與此同時，計算與實驗相交融的系統(tǒng)生物學研究策略和生物信息學方法，在生物網(wǎng)絡的研究中正發(fā)揮著越來越重要的作用，成為生命科學和醫(yī)學研究從“還原論”走向“系統(tǒng)論”及從“描述性”轉(zhuǎn)為“預測性”的一個重要標志。

Genclip是一種文獻挖掘軟件，可對基因芯片的差異表達基因進行特定的功能聚類，以及構(gòu)建特定功能的基因網(wǎng)絡[20]。將每個基因?qū)胲浖?，不僅能顯示出該基因諸多的名稱，也能給出該基因的功能注釋和文獻摘要。使用者還可以根據(jù)自己的研究方向添加和組合關鍵詞，然后進行基因與基因之間關系的挖掘，最后得出的是基于待分析基因和指定關鍵詞的信號通路（網(wǎng)絡）。該軟件利用的文獻是不斷更新的，所以挖掘的基因與關鍵詞的關系總是處于不斷更新中，挖掘出來的疾病機制也總是最新的。本研究從復雜生物網(wǎng)絡的角度切入，以中醫(yī)辨證的常見證型——氣虛證為例，通過挖掘與證候表征相關的基因而構(gòu)建證候的生物分子網(wǎng)絡，從不同角度進行證候生物分子網(wǎng)絡構(gòu)建的研究，通過分析、整合NEI的典型調(diào)控環(huán)節(jié)，以及激素、細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)的相互作用，探索氣虛證的生物學基礎。通過比較、分析文獻挖掘的數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)氣虛相關集群與內(nèi)分泌、信號傳導、造血細胞系、炎癥反應等相關，從而表明本方案可以對中醫(yī)證型的內(nèi)在生物學特征進行有效地辨識。

文獻挖掘作為一種即省時、省力又簡單易行的挖掘證候生物學指標的方法，也正在被越來越多的研究人員所采納。但作為一種新的挖掘證候生物學指標的方法來說，本研究還存在一些不足，主要表現(xiàn)為研究“深度”和“廣度”不足兩個方面：“深度”方面，實驗所采用的文獻挖掘方法挖掘出的基因的準確性還未達到非常理想的程度，后期可以考慮引入更多的挖掘方法進行對比分析，以提高挖掘的準確度；而“廣度”方面，本研究僅對氣虛證進行了系統(tǒng)研究，下一步還需要擴大到其他證型的研究中，從而進一步驗證該方法的普適性和可靠性。

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（收稿日期：2014-10-27）

（修回日期：2014-12-05；編輯：華強）