脫酰胺處理對小麥面筋蛋白多菌種發(fā)酵的影響

張少敏等

摘要：[目的]研究脫酰胺處理對小麥面筋蛋白多菌種發(fā)酵的影響。[方法]使用米曲霉和乳酸菌發(fā)酵脫酰胺度為37%、50%和65%的小麥面筋蛋白，研究了脫酰胺處理對發(fā)酵液總酸、還原糖、肽氮、游離氨基酸組成以及呈味特性的影響。[結(jié)果]試驗表明，脫酰胺處理可以提高發(fā)酵液中肽氮、總酸和還原糖含量，其中，脫酰胺度50%的面筋蛋白發(fā)酵液中的肽氮含量達(dá)0.77 g/ml，相較于空白提高了11.93%，脫酰胺度37%的面筋蛋白發(fā)酵液中總酸含量為1.35 g/ml，比空白提高了16%，脫酰胺度50%的面筋蛋白發(fā)酵液中還原糖含量相對空白提高25%；同時脫酰胺處理降低了發(fā)酵液中疏水氨基酸的比例，脫酰胺度50%和65%的面筋蛋白發(fā)酵液中的游離谷氨酸的含量顯著提高。[結(jié)論]研究可為使用小麥面筋蛋白制備呈味基料提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：小麥面筋蛋白；脫酰胺；發(fā)酵；感官評價

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-257-02

小麥面筋蛋白，又稱活性小麥面筋，是生產(chǎn)小麥淀粉時的一種副產(chǎn)物[1]。小麥面筋蛋白中富含谷氨酰胺和天冬酰胺等疏水性氨基酸，導(dǎo)致其在水中分散性差，限制其在食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用[2-3]。脫酰胺改性將面筋蛋白中的谷氨酰胺和天冬酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸和天冬氨酸，增大蛋白質(zhì)側(cè)鏈的靜電斥力，提高水溶特性，改善酶解敏感性[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵前對面筋蛋白進(jìn)行一定的改性可改善其發(fā)酵品質(zhì)[5-6]。米曲霉是我國傳統(tǒng)釀造醬油時常使用的菌株，富含多種酶類，發(fā)酵工業(yè)常采用米曲霉固體制取產(chǎn)生的復(fù)合酶系。利用多菌種混合發(fā)酵具有成本低、風(fēng)味獨特、酶解效率高等優(yōu)點，適宜工業(yè)化生產(chǎn)[7]。

筆者選取了以3種不同濃度的鹽酸處理得到的不同脫酰胺程度的小麥面筋蛋白作為原料進(jìn)行發(fā)酵，研究了經(jīng)過脫酰胺處理得到的不同脫酰胺度的小麥面筋蛋白經(jīng)發(fā)酵后所得產(chǎn)品的肽氮、總酸的含量，以及對游離氨基酸組成和呈味特性的影響，為使用小麥面筋蛋白制備呈味基料提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。小麥，市售；焙炒小麥，實驗室自行炒制；小麥面筋蛋白，河南蓮花味精集團(tuán)；光明曲精（滬釀3.042米曲霉孢子粉，孢子發(fā)芽率≥80%，孢子數(shù)≥1010/g干基，水分≤10%），上海釀造一廠；乳酸菌CICC6064，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備。

精密電子天平JJ500型，上海亞津電子科技有限公司；凱式定氮儀KND-2C型，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-0，蘇州學(xué)森儀器設(shè)備公司；紫外可見UV-2100型分光光度計，上海尤尼科儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱HPX-9052MBE，常州諾基儀器有限公司；立式殺菌鍋JYS-900，利宏輕工機(jī)械有限公司；電熱恒溫水浴鍋，北京市醫(yī)療設(shè)備廠；JJ-1B恒速強(qiáng)力電動攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司；全自動電位滴定儀CBS-1D型，哈希TitraLab儀器設(shè)備有限公司；全自動氨基酸分析儀A300型，曼默博爾（德國）有限公司，等。

1.1.3 主要試劑。

福林酚、酪蛋白、Na2CO3、HCl、H2SO4、硒粉、K2SO4、硼酸、NaOH、甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4、無水乙醇，所用試劑均為分析純。

1.2 方法 小麥面筋蛋白脫酰胺工藝[8]：取 0～0.42 mol/L 的 HCl 與小麥面筋蛋白（0.24 g/ml）配制成混合溶液，在水浴搖床中（50～90 ℃）振蕩一定時間（0～36 h）后冷卻制得一定脫酰胺程度的酶解前處理樣品。同樣配制上述混合溶液，在水浴搖床中振蕩一定時間后冷卻離心（9 500 r/min，10 min）。取上清液測脫酰胺度。假設(shè)采用脫酰胺度為37%的小麥面筋蛋白進(jìn)行發(fā)酵的工藝為A工藝，50%為B工藝，65%為C工藝，未進(jìn)行脫酰胺處理的小麥面筋蛋白為空白對照。

脫酰胺處理后小麥面筋蛋白發(fā)酵工藝：全小麥焙炒→粉碎→潤水（接種量為107 cfu/g乳酸菌）→造粒[9]→接種→出曲→添加脫酰胺處理小麥面筋蛋白和鹽水[小麥面筋蛋白∶大曲∶鹽水=1∶1∶5（g∶g∶g），18%鹽水]→入發(fā)酵罐發(fā)酵→發(fā)酵過程中定期取樣后4 ℃冰箱貯藏。

1.3 分析方法 總氮的測定：凱氏定氮法，參考GB 5009.5-2010，食品中蛋白質(zhì)的測定。

總酸的測定：氫氧化鈉滴定法。

氨基酸態(tài)氮的測定：甲醛滴定法，參考GB/T 5009.39-2003， 醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法。

肽氮的測定：發(fā)酵液中總氮與氨基酸態(tài)氮含量之差。

游離氨基酸的含量分析： 4 ml樣品，加入1 ml磺基水楊酸，置于4 ℃冷藏60 min后10 000 r/min離心15 min，取上清液稀釋100倍，調(diào)pH為2.2后0.2 μm濾膜過濾。用menbraPureTS263鋰離子交換柱，取濾液20 μl，梯度洗脫，茚三酮柱后衍生，反應(yīng)溫度為115 ℃，流動相流速為120 μl/min，茚三酮流速為60 μl/min，在570 nm處測吸光值，脯氨酸在440 nm處測吸光值。數(shù)據(jù)分析：將所有測試重復(fù)進(jìn)行3次，用SPSS 14.0統(tǒng)計分析軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中總氮含量的變化 如圖1所示，發(fā)酵初期蛋白酶活力高造成總氮含量上升明顯，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蛋白酶活力逐漸下降導(dǎo)致中后期總氮含量增長趨于平緩。發(fā)酵初始階段，A、B樣品的總氮含量高于空白樣，而5 d后，空白樣品的總氮含量高于其他樣品，這主要因為對面筋蛋白進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拿擋０诽幚砜杉涌彀l(fā)酵前期的總氮溶出速率，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，空白原料在自身內(nèi)源酶和種曲中酶的共同作用下促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)行。在整個發(fā)酵過程中C樣品的總氮含量始終低于其他樣品的，原因可能是過度脫酰胺鈍化了其酶解敏感性。

2.2 發(fā)酵過程中氨態(tài)氮含量的變化 氨態(tài)氮是評價發(fā)酵液營養(yǎng)價值的重要參考。在發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)在微生物發(fā)酵的作用下產(chǎn)生一些小分子肽和氨基酸，其含量變化如圖2所示。與總氮變化趨勢相似，發(fā)酵初期全部樣品的氨態(tài)氮含量明顯升高，在后期增長速度放緩。發(fā)現(xiàn)在整個發(fā)酵過程中，空白樣品的氨態(tài)氮含量始終高于A、B、C樣品的，其氨態(tài)氮含量在第30天時達(dá)到9.4 g/L，這可能是由于脫酰胺處理后的樣品的高鹽度產(chǎn)生了高滲透壓及強(qiáng)離子靜電效應(yīng)，它們破壞蛋白酶的穩(wěn)定性，進(jìn)而造成蛋白質(zhì)水解度降低，氨態(tài)氮含量增長放緩。同時，B和C樣品的氨態(tài)氮含量始終高于A的，在30 d時分別比A樣品高6.26%和4.95%。

2.3 發(fā)酵過程中肽氮含量的變化 大豆蛋白在曲霉的蛋白酶作用下會分解為可溶肽段，需要肽酶的作用進(jìn)一步分解成為游離氨基酸。如圖3所示，所有樣品在發(fā)酵過程中肽氮的含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，其中A和B的肽氮含量高于空白，到發(fā)酵結(jié)束時B樣品肽氮含量最高，達(dá)到7.7 g/L，比空白高出11.93%。綜上，脫酰胺度為37%和50%的小麥面筋蛋白有利于發(fā)酵液多肽的產(chǎn)生。

2.4 發(fā)酵過程中總酸含量的變化 有機(jī)酸不僅可以增強(qiáng)酶解液的酸味，還能夠提高其緩沖能力，加強(qiáng)呈味效果。如圖4所示，在整個發(fā)酵過程中，總酸的含量呈上升趨勢，且在初期的增長速率要高于后期。發(fā)酵過程中A、B、C 3個樣品的總酸含量始終高于空白樣品，30 d時，A樣品的總酸含量為13.5 g/L，比空白提高了16%。發(fā)酵初期，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)充分，耐鹽性乳酸菌大量增殖，導(dǎo)致總酸含量顯著上升，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸和酒精等中間產(chǎn)物的逐漸積累，抑制乳酸菌的活動，導(dǎo)致后期酸度增速變緩。

2.5 發(fā)酵成品游離氨基酸結(jié)果 由表1可知，在樣品中含量較高的氨基酸是谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸，這4種氨基酸的含量分別占空白、A、B和C的總游離氨基酸量的48.5%、46.03%、51.49%和50.88%。鮮味氨基酸，谷氨酸和天門冬氨酸，在空白、A、B和C的含量和占據(jù)總氨基酸的比例分別是20 461.7 mg/L，17.42%；17 387.8 mg/L，14.94%；24 655.8 mg/L，23.87%以及27 462.2 mg/L，27.27%。其中谷氨酸的含量和比例分別為16 574.6 mg/L，11.97%；13 929.4 mg/L，21.67%；22 387.8 mg/L，25.30%以及25 471.0 mg/L，14.11%。由此可知，谷氨酸含量隨著脫酰胺的上升而增加，這也使得鮮味氨基酸的含量上升，同時谷氨

酰胺則隨之上升而降低。含有疏水氨基酸和苦味氨基酸的多肽會造成蛋白酶解液的苦味。A、B和C樣品中的疏水性氨基酸比例顯著低于空白樣品的（P<0.05），說明脫酰胺處理可以有效減少疏水氨基酸的含量。

3 結(jié)論

通過使用脫酰胺的小麥面筋蛋白進(jìn)行發(fā)酵試驗，研究了脫酰胺處理對面筋蛋白發(fā)酵液的各種理化指標(biāo)，游離氨基酸組成和呈味特性的影響，得到以下結(jié)論：

脫酰胺度為37%和50%的面筋蛋白可以提高發(fā)酵液中肽氮的含量，30 d時，肽氮含量分別為7.7 g/L和7.5 g/L，比空白提高了11.93%和9.34%。

脫酰胺處理可以提高發(fā)酵液中游離谷氨酸的含量，隨著脫酰胺度的提高含量越高；能夠顯著降低樣品中的疏水性氨基酸，提高鮮味氨基酸的含量。

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