紫山藥花色苷生物酶法提取工藝優(yōu)化研究

霍艷榮　高前欣　王振宇

摘要 [目的]優(yōu)化紫山藥花色苷生物酶法提取工藝。[方法]選擇纖維素酶及果膠酶對(duì)紫山藥花色苷的提取效果進(jìn)行對(duì)比分析，對(duì)纖維素酶法提取紫山藥花色苷的工藝進(jìn)行優(yōu)化，選用酶用量、時(shí)間、溫度、料液比進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)。[結(jié)果]試驗(yàn)表明，纖維素酶能顯著提高花色苷得率。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳提取方案為：提取溫度50 ℃，提取時(shí)間60 min，酶用量2.0%，料液比1∶15 g/ml。[結(jié)論]研究可為紫山藥花色苷的提取應(yīng)用提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫山藥；花色苷；提取工藝；生物酶法

中圖分類號(hào)：S632.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）08-253-02

紫山藥富含多糖、黏液質(zhì)、蛋白質(zhì)、淀粉、多種氨基酸及礦物元素，具有多種功能性組分如薯蕷皂苷、尿囊素、多酚、植物固醇、花青素等[1-3]。紫山藥的營(yíng)養(yǎng)成分及主要功能組分含量與懷山藥基本一致[4-5]。

花色苷是花色素與各種糖結(jié)合而形成的黃酮多酚類化合物。花色苷具有抗氧化活性，這種活性使其在預(yù)防一些神經(jīng)性心血管方面疾病以及癌癥、糖尿病等方面具有非常關(guān)鍵的作用[6-7]。花色苷在食品工業(yè)中應(yīng)用較多，它是水溶性的物質(zhì)，可以從葡萄、紫甘藍(lán)、紅蘿卜、郁金香等果蔬及植物中提取獲得。因?yàn)榛ㄉ帐蔷哂芯S管束植物中的最重要的色素，而這些色素使一些果蔬和植物展現(xiàn)出鮮亮的橘色、紅色及藍(lán)色等，易與水溶性介質(zhì)混合，因此可以作為天然的水溶性色素應(yīng)用于食品中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料。紫山藥，收獲于浙江農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地。

1.1.2 試劑。纖維素酶（6萬U/g）、果膠酶（80萬U/g），購于張家港市金源生物化工有限公司；檸檬酸、氫氧化鈉、緩沖溶液，均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備。

紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pHS-2C型精密酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；大容量低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；JJ300型精密電子天平，美國雙杰兄弟（集團(tuán)）有限公司；精密電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DGG-9053AD型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫山藥花色苷酶法提取工藝流程。

新鮮紫山藥樣品→清洗→去皮→切片→護(hù)色（1%檸檬酸溶液）→干燥→粉碎→加酶→溶劑浸提→離心→測(cè)吸光度值。

1.2.2 紫山藥預(yù)處理。

將新鮮紫山藥洗凈，去皮，切片，護(hù)色，烘干，粉碎，過80目篩，紫山藥粉末裝入自封袋中密封避光保存。

1.2.3 酶法提取紫山藥花色苷的單因素試驗(yàn)。

在其他條件不變的情況下，分別考察酶解提取加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、料液比及pH對(duì)提取效果的影響，根據(jù)提取液色價(jià)大小確定最佳提取條件。

1.2.3.1 酶用量對(duì)提取效果的影響。

稱取紫山藥粉末2.0 g，加入30 ml蒸餾水搖勻，分別加入0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的2種酶，45 ℃浸提45 min，離心15 min，取上清液測(cè)定吸光度，并計(jì)算花色苷溶液的色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小確定最佳酶用量。

1.2.3.2 酶解時(shí)間對(duì)提取效果的影響。

稱取紫山藥粉末2.0 g，加入30 ml蒸餾水搖勻，分別加入30 mg 2種酶，45 ℃分別浸提15、30、45、60、75、90 min，離心15 min，取上清液測(cè)定吸光度，計(jì)算花色苷溶液的色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小確定最佳提取時(shí)間。

1.2.3.3 酶解溫度對(duì)提取效果的影響。稱取紫山藥粉末2.0 g，加入30 ml蒸餾水搖勻，分別加入30 mg 2種酶，分別于25、30、35、40、45、50 ℃浸提45 min，離心15 min，取上清液，測(cè)定吸光度，并計(jì)算花色苷溶液的色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小確定最佳提取溫度。

1.2.3.4 料液比對(duì)提取效果的影響。

稱取紫山藥粉末2.0 g，按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/ml與蒸餾水搖勻，分別加入30 mg 2種酶，45 ℃浸提45 min，離心15 min，取上清液測(cè)定吸光度，并計(jì)算花色苷溶液的色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小確定最佳料液比。

1.2.3.5 pH對(duì)提取效果的影響。

稱取紫山藥粉末2.0 g，加入30 ml蒸餾水搖勻，調(diào)pH至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，分別加入30 mg 2種酶，45 ℃的恒溫水浴鍋中浸提45 min，離心15 min，取上清液測(cè)定吸光度，并計(jì)算花色苷溶液的色價(jià)，根據(jù)色價(jià)大小確定最佳pH。

1.2.4 纖維素酶對(duì)紫山藥花色苷最佳提取條件的確定。根據(jù)單因素的結(jié)果，以酶用量、提取時(shí)間、提取溫度和料液比為影響因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)安排如表1所示。

1.2.5 紫山藥含量的檢測(cè)。

在波長(zhǎng)535 nm下對(duì)花色苷溶液進(jìn)行吸光度檢測(cè)（以蒸餾水做空白），并計(jì)算色價(jià)。色價(jià)計(jì)算式：

E1%1cm=AV/W

式中，E1%1cm，色價(jià)；A，提取液吸光度；V，提取液的總體積（ml）；W，固體樣品的質(zhì)量（g）。當(dāng)V=100 ml，W=1 g時(shí)，將公式簡(jiǎn)化為E1%1cm=A。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶用量對(duì)紫山藥花色苷提取效果的影響 由圖1可知，在一定酶用量范圍內(nèi)，隨著酶用量的增加，吸光度值也隨著升高，這主要是由于底物濃度一定時(shí)，酶的濃度較低時(shí)，酶解進(jìn)行的不完全，酶促反應(yīng)速度與酶的初始濃度成正比，即隨著酶用量的增加而增加。當(dāng)酶用量與底物結(jié)合達(dá)到平衡時(shí)，吸光度值達(dá)到最大，酶用量繼續(xù)增加時(shí)，吸光度值有所降低。得率最大時(shí)纖維素酶的用量比果膠酶少，且纖維素酶的得率比果膠酶大。

2.2 酶解時(shí)間對(duì)紫山藥花色苷提取效果的影響 由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值增大，說明提取的得率增加，當(dāng)達(dá)到60 min時(shí)，吸光度達(dá)到最大值，且纖維素酶的得率比果膠酶大。60 min以后，吸光度值開始降低，這可能是由于時(shí)間延長(zhǎng)使得色素有所分解。

2.3 酶解溫度對(duì)紫山藥花色苷提取效果的影響 由圖3可知，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，吸光度增大，這主要是因?yàn)闇囟壬呤姑傅幕钚栽鰪?qiáng)，從而促進(jìn)細(xì)胞壁的分解，加速可溶性物質(zhì)的擴(kuò)散和溶出，促進(jìn)色素的浸出。當(dāng)溫度分別達(dá)到40、50 ℃時(shí)，纖維素酶、果膠酶分別達(dá)到酶的最適反應(yīng)溫度，因此吸光度達(dá)到最大值；溫度繼續(xù)升高，吸光度值開始降低，主要原因是由于酶的活性有所降低，并且溫度升高會(huì)導(dǎo)致紫山藥花色苷的分解。取得最大值時(shí)，纖維素酶的溫度比果膠酶低，且纖維素酶的最大值比果膠酶大。

2.4 料液比對(duì)紫山藥花色苷提取效果的影響 由圖4可知，隨著料液比中溶劑用量的增加，吸光度值下降，花色苷的提取量降低，這主要是因?yàn)榱弦罕戎腥軇┯昧吭黾?，酶的濃度隨之降低，提取率下降。

2.5 pH對(duì)紫山藥花色苷提取效果的影響 由圖5可知，在酸性條件下，隨著pH的增大，吸光度值也增大，這主要是因?yàn)樯卦诓煌膒H條件下會(huì)發(fā)生顏色的改變，pH在3.5時(shí)，顏色為偏粉紅色，pH為5.0時(shí)，顏色為紫紅色，pH到達(dá)6.5時(shí)，顏色為紫色。因此吸光度值的增大主要是色素色澤的影響，無法辨別得率的大小。

2.6 纖維素酶法提取紫山藥花色苷的正交試驗(yàn)結(jié)果與分析 由正交試驗(yàn)結(jié)果可知（表2），影響紫山藥花色苷提取效果因素順序?yàn)椋篊>B>A>D，即先后順序?yàn)槊赣昧?、提取時(shí)間、提取溫度、料液比。纖維素酶助提取最佳條件為：A3B2C3D1，即酶解提取溫度為50 ℃，提取時(shí)間為60 min，酶用量為2.0%，料液比為1∶15 g/ml。

3 結(jié)論

紫山藥中淀粉及果膠的存在會(huì)影響花色苷的溶出，因此選用纖維素酶和果膠酶進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，纖維素酶對(duì)花色苷的提取效果較顯著。通過正交試驗(yàn)得出，纖維素酶酶解提取紫山藥花色苷最佳提取條件為：酶用量2.0%，提取時(shí)間60 min，提取溫度50 ℃，料液比1∶15 g/ml。

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