食品中金黃色葡萄球菌定量檢測方法比較研究

曹建平　韓丹　王健

摘要：[目的] 探求一種適應(yīng)食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的快速準(zhǔn)確的方法。[方法]比較研究Baird-Parker平板法、MPN法、科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基法和PetrifilmTM測試片法這4種定量方法對金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應(yīng)用。[結(jié)果]試驗(yàn)顯示，4種方法檢測金黃色葡萄球菌選擇性良好；MPN法、顯色培養(yǎng)基法和紙片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高；4種方法應(yīng)用在食品檢測中，金黃色葡萄球菌檢出率無顯著差異。因此可選擇顯色培養(yǎng)基和PetrifilmTM測試紙片法作為日常檢驗(yàn)的輔助手段，以提高檢測靈敏度、縮短檢驗(yàn)周期。[結(jié)論] 研究可為食品檢測方法的研究及應(yīng)用積累一定的經(jīng)驗(yàn)，為今后金黃色葡萄球菌的檢測工作提供一定參考。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；定量檢測方法；比較研究

中圖分類號：S182 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號 0517-6611（2015）08-242-02

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬，是一種重要的病原菌，是典型的革蘭氏陽性菌，有較強(qiáng)的抵抗力。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，且有高度的耐鹽性，容易污染肉類、水產(chǎn)品、乳品等食品，在世界各個(gè)國家中，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒在細(xì)菌性食物中毒中均占較大比例[1-2]，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。

目前關(guān)于食品中金黃色葡萄球菌的定量檢測方法主要有Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法[3]、MPN計(jì)數(shù)法[3]、測試紙片法[4]、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法等。其中Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法為國標(biāo)法的第二法和第三法，但兩者都存在耗時(shí)、工作量大的缺陷，很難適應(yīng)現(xiàn)在快速檢驗(yàn)要求；測試紙片法、顯色培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法檢測周期短、工作量小，已經(jīng)得到了很多機(jī)構(gòu)的認(rèn)可。筆者比較研究了這4種定量方法對金黃色葡萄球菌的選擇性、靈敏度和在食品中的應(yīng)用，以Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法為基準(zhǔn)，將結(jié)果進(jìn)行比較分析研究，旨在探求一種適應(yīng)食品微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)要求的快速準(zhǔn)確的方法，為食品檢測方法的研究及應(yīng)用積累一定的經(jīng)驗(yàn)，為今后金黃色葡萄球菌的檢測工作提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及培養(yǎng)基。

平板計(jì)數(shù)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、BHI肉湯、Baird-Parker瓊脂基礎(chǔ)、卵黃亞碲酸鉀增菌劑、凍干血漿，青島海博生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液，北京陸橋；科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司；PetrifilmTM6491金黃色葡萄球菌測試片、PetrifilmTM6493金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片，美國3M公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、表皮葡萄球菌（ATCC29069），寧波市鄞州區(qū)食品檢測中心提供。

1.1.3 樣品。

采集寧波市農(nóng)貿(mào)市場及超市的食品50份， 其中生肉類10份、熟肉制品10份、生牛奶10份、豆制品10份、糕點(diǎn)10份。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)。Baird-Parker平板計(jì)數(shù)法：按GB 4789.10-2010第二法檢驗(yàn)。

MPN法：按GB 4789.10-2010第三法檢驗(yàn)。

科瑪嘉金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基平板法：每個(gè)稀釋度分別吸取1 ml樣品勻液以0.3、0.3、0.4 ml接種量分別加入3塊顯色培養(yǎng)基平板上，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣，按說明書判讀。

PetrifilmTM測試片計(jì)數(shù)法：取1 ml稀釋好的菌液接入測試片，靜置測試片1 min，（36±1）℃培養(yǎng)24 h，按說明書判讀，有可疑菌落時(shí)，用確認(rèn)反應(yīng)片做補(bǔ)充試驗(yàn)。

1.2.2 選擇性鑒定試驗(yàn)。

將3株試驗(yàn)菌株分別劃線接種于Baird-Parker平板和顯色培養(yǎng)基平板；MPN法的鑒定同Baird-Parker平板；以生理鹽水作10倍系列稀釋，取1 ml接種PetrifilmTM測試片（使菌液終濃度在100～1 000 CFU/ml）；36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察各菌株的典型生長情況，并進(jìn)行特異性比較。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn)。

在4種培養(yǎng)基上加入不同菌濃度的金黃色葡萄球菌菌懸液，每個(gè)測試作2個(gè)平行，按“1.2.1”方法培養(yǎng)，判讀，計(jì)數(shù)，同時(shí)以平板計(jì)數(shù)瓊脂傾注法計(jì)算菌濃度作對照，評價(jià)4種試驗(yàn)方法的檢測靈敏度。

1.2.4 食品中檢測應(yīng)用 。

無菌生理鹽水作10倍系列稀釋同一樣品后，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪确謩e按“1.2.1”方法檢測，結(jié)果用SPSS 18.0軟件以χ2檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性試驗(yàn)比較 3株試驗(yàn)菌株中，金葡菌在4種培養(yǎng)基中生長良好（MPN法最終也是用BP平板篩選），特征菌落明顯，表皮葡萄球菌在4種培養(yǎng)基中雖然有生長，但無典型特征性菌落，大腸埃希氏菌在4種培養(yǎng)基中均不生長，結(jié)果見表1。分析結(jié)果得出，各種培養(yǎng)基對金葡菌的選擇性都良好，符合計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的選擇性要求。

2.2 靈敏性試驗(yàn) 用4種檢測方法分別對金葡菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，MPN法、顯色培養(yǎng)基法和PetrifilmTM測試片法靈敏度比Baird-Parker平板法稍高一個(gè)數(shù)量級，但均能滿足計(jì)數(shù)要求，結(jié)果見表2。

2.3 食品中金黃色葡萄球菌檢出結(jié)果分析 50批樣品中金葡菌的檢出率如表3所示。顯色培養(yǎng)基法、MPN法和紙片法檢出率分別為24%、22%和22%，結(jié)果差不多，檢出率比Baird-Parker平板法的稍高。但通過SPSS統(tǒng)計(jì)分析表明，MPN法、顯色培養(yǎng)基法、紙片法和Baird-Parker平板法無顯著差異（χ2=2.64<χ20.05，12，P>0.05）。

2.4 金黃色葡萄球菌各種定量檢驗(yàn)方法比較 對檢測金黃色葡萄球菌幾種方法指標(biāo)的評價(jià)見表4。Baird-Parker法需涂布后觀察然后挑去可疑菌落轉(zhuǎn)接BHI肉湯后，再做血漿凝固酶進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，耗時(shí)3～4 d。MPN法更是需要對樣品先進(jìn)行增菌，然后再接種觀察培養(yǎng)驗(yàn)證，耗時(shí)更長，步驟更是繁瑣、量大。顯色培養(yǎng)基、測試片法是基于微生物自身代謝產(chǎn)生的酶與相應(yīng)顯色底物反應(yīng)顯色的原理，顯色培養(yǎng)基臨用前加熱煮沸溶解即可使用，接種后24 h觀察結(jié)果，無需證實(shí)試驗(yàn)；紙片法只需培養(yǎng)后對可疑菌落加確認(rèn)反應(yīng)片驗(yàn)證即可對最終結(jié)果進(jìn)行判定。在實(shí)際檢驗(yàn)運(yùn)用中，顯色培養(yǎng)基、測試片法較傳統(tǒng)培養(yǎng)基有工作量少、使用簡便、靈敏度高、周期短的優(yōu)點(diǎn)，但顯色培養(yǎng)基和測試片成本要比Baird-Parker法和MPN法高。

3 結(jié)論與討論

金黃色葡萄球菌其菌落有典型的金黃色特征，是食源性致病菌的一種，但在日常檢測過程中，常會(huì)造成金黃色色素不典型的現(xiàn)象，若單純使用傳統(tǒng)Baird-Parker平板和血平板，容易造成誤判，張琳從BP平板上隨機(jī)挑取典型菌落做血漿凝固酶驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果檢出率為66%[5]，這一結(jié)果與一文獻(xiàn)中報(bào)道的相符合[6]，這漏檢往往會(huì)導(dǎo)致食品安全事故。Baird-Parker法涂布時(shí)受人員熟練程度等人為因素影響，菌落有時(shí)分布不均勻而難以計(jì)數(shù)。當(dāng)樣品中金葡菌濃度低時(shí)，Barid-Parker法和MPN法結(jié)果沒有顯著差異，但Barid-Parker法更接近理論值，一般不選擇MPN法[7]?？片敿谓瘘S色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基可直觀上對幾種葡萄球菌進(jìn)行有效區(qū)分，避免了漏檢和誤判，節(jié)省了檢測時(shí)間。PetrifilmTM測試片，操作步驟標(biāo)準(zhǔn)化，人為誤差較小，攜帶方便尤其適合現(xiàn)場取樣檢驗(yàn)。但測試片法計(jì)數(shù)時(shí)，黑色或藍(lán)綠色的可疑菌落較多，而紫紅色菌落相對較少，加確認(rèn)片反應(yīng)后，也只有少量菌落有粉紅色暈圈。因此使用測試片法計(jì)數(shù)時(shí)，如雜菌過多，則將會(huì)影響結(jié)果，建議同時(shí)多做幾個(gè)稀釋度。

通過比較，雖然顯色培養(yǎng)基法及測試片法成本較高，但金黃色葡萄球菌的檢出率與傳統(tǒng)國標(biāo)法即Barid-Parker平板法和MPN法相比無顯著差異，卻極大地縮短了檢測時(shí)間，且操作簡便。在實(shí)際檢測工作中，可將選擇顯色培養(yǎng)基和PetrifilmTM測試紙片法作為日常檢驗(yàn)的輔助手段，在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中推廣應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 李自然，施春雷，宋明輝，等.上海市食源性金黃色葡萄球菌分布狀況[J].食品科學(xué)，2013，34（1）：268-271.

[2] 陳廣全，張惠媛，曾靜.食品安全檢測培訓(xùn)教材 微生物檢驗(yàn)[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010：351-352.

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.10-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn) [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1895-2007 食品中金黃色葡萄球菌的快速計(jì)數(shù)法PetrifilmTM 測試片法[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

[5] 張琳.食品中金黃色葡萄球菌檢測方法的比較研究[J].食品工業(yè)科技，2006，27（6）：166-169.

[6] SCHOELLER N P，LNGHAM S C.Comparison of the Baird-Parker agar and 3MTM Petrifilm rapid S.aureus count plate methods for detection and enumeration of Staphylococcus aureus[J]. Food Microbiol， 2001，18：581-587.

[7] 陸嵐，張勇，張勇琪，等.金黃色葡萄球菌定量檢驗(yàn)方法研究[J].大家健康，2011，5（11）：39-40.