綠絨海芋Alocasia micholitziana的組織培養(yǎng)及其植株再生的研究

楊建芬 郭彭斐 張兵劃 張壽洲

摘 ?要 ?以綠絨海芋Alocasia micholitziana的葉片、葉柄為外殖體，研究不同滅菌劑對(duì)外殖體消毒效果的影響、不同激素及濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化及增殖的影響。結(jié)果表明：（1）消毒處理時(shí)葉柄適于用0.1% HgCl2浸泡處理8 min，葉片則為7 min;（2）葉柄、葉片在所試培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA，葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%;（3）從愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基為MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，誘導(dǎo)率可達(dá)100%;（4）在培養(yǎng)基MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA上，芽增殖效果最佳，苗生長(zhǎng)健壯;（5）最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L IBA，移栽后苗容易成活;（6）苗移栽時(shí)以泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）成活率較高，可達(dá)98%以上，而且小苗生長(zhǎng)健壯。

關(guān)鍵詞 ?綠絨海芋;葉柄、葉片;組織培養(yǎng);植株再生

中圖分類號(hào) ?S665 ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ? A

Tissue Culture and Plantlet Regeneration of

Alocasia micholitziana

YANG Jianfen，GUO Pengfei，ZHANG Binhua，ZHANG Shouzhou*

Laboratory of Southern Subtropical Plant Diversity， Fairylake Botanical Garden， Shenzhen

& Chinese Academy of Sciences， Shenzhen， Guangdong 518004， China

Abstract ?An efficient protocol was established for the regeneration of an ornamental and food crop plant， ?Alocasia micholitziana using the leaves and petiole explants. The influence of both plant sterilization agents and various growth hormones at different concentrations on callus induction， adventitious bud differentiation and their proliferation were examined. The results ?revealed that soaking of plant explants in 0.1% of HgCl2 solution for 8 min was suitable for sterilization. The highest bud induction（100%）was achieved in three plant growth hormone combinations of 6-BA（2 mg/L）， 2，4-D（2 mg/L）and NAA（0.1 mg/L）in the MS culture medium. The optimum concentration for the highest induction（100%）of adventitious bud was 2 mg/L of 6-BA with 0.4 mg/L of NAA. The root was successfully induced in the half strength MS medium augmented with 0.5 mg/L of IBA. The in vitro regenerated plants were transf erred to the pot containing peat soil， perlite， and vermiculite（3 ∶ 1 ∶ 1）which showed the maximum survival rate（98%）.

Key words ?Alocasia micholitziana; Petioles; Leaf; Tissue culture; Plant regeneration

doi ?10.3969/j.issn.1000-2561.2015.08.015

綠絨海芋Alocasia micholitziana（Green velvet）是天南星科海芋屬植物，原產(chǎn)熱帶地區(qū)，為多年生草本，葉片姿態(tài)優(yōu)美、葉色濃綠，葉面有絲絨般感覺(jué)，葉脈銀白、清晰如畫，極富詩(shī)情畫意，為風(fēng)格獨(dú)特的觀葉植物。室內(nèi)擺設(shè)，高貴典雅。可水栽，淋洗盆土后，種于玻璃瓶中更顯清潔清爽，是觀賞價(jià)值較高的室內(nèi)觀葉植物。綠絨海芋（圖版1-F）是從國(guó)外新引進(jìn)開(kāi)發(fā)的園藝品種，目前處于種苗繁育階段，僅有少量種苗供應(yīng)市場(chǎng)。常規(guī)繁殖主要是通過(guò)分株方式和播種，其種子來(lái)源有限，自然分株率又低，周期長(zhǎng)，很難滿足市場(chǎng)需要。利用組培方式可以快速繁殖種苗，達(dá)到推廣應(yīng)用的目的。海芋屬植物組培報(bào)道的有海芋（Alocasia indica Schott）[1-3]、亞馬遜海芋（Alocasia amazonica）[4]、紫色莖稈海芋（Alocasia macrorrhiza）[5]、黑絨觀音蓮（Alocasia ‘Black Velver）[6]， 綠絨海芋的組培技術(shù)研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)涉及，而國(guó)外已有報(bào)道[7]，但其愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月，出愈率僅71%，本研究的最佳培養(yǎng)基MS+2 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA，至45 d時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%，大大縮短了離體培養(yǎng)時(shí)間，并且叢生芽增殖率也高，更適于工廠化規(guī)模生產(chǎn)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為從臺(tái)灣辜嚴(yán)倬云保種中心引種回來(lái)的綠絨海芋，栽種于深圳市中科院仙湖植物園引種區(qū)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?外殖體的消毒處理 ? 當(dāng)綠絨海芋新長(zhǎng)出的幼葉完全展開(kāi)5 d左右，將葉片和葉柄一起剪下。清洗干凈表面塵土后，用洗潔精水泡洗5～10 min，再用自來(lái)水沖洗，直到徹底將洗潔精清洗干凈為止。在無(wú)菌操作室內(nèi)，將葉柄和葉片分開(kāi)，分別用0.1%升汞溶液、5% NaClO溶液浸泡6～10 min，滅菌水沖洗4～6次，消毒濾紙吸干表面水分，將葉片切成1 cm×1 cm左右的方塊，葉柄切成1 cm左右的段，然后分別接入不同培養(yǎng)基中。隨時(shí)觀察記錄，35 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

污染率=（污染外殖體數(shù)/接種總數(shù)）×100%;剔除污染外殖體后，死亡率=（死亡外殖體數(shù)/未污染外殖體數(shù)）×100%。

1.2.2 ?愈傷組織及不定芽的誘導(dǎo) ? 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置①6-BA 1.5 mg/L與2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5）mg/L和②6-BA 2.0 mg/L與2，4-D（0.5、1.0 、1.5、2.0、2.5）mg/L共10個(gè)處理，研究不同激素及濃度配比的培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響。不定芽的統(tǒng)計(jì)以肉眼可辯獨(dú)立單芽為準(zhǔn)。

分化率=（分化愈傷組織塊數(shù)/接種愈傷組織塊數(shù)）×100%。

1.2.3 ?不定芽的繼代增殖 ? 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置①6-BA 1.5 mg/L、2，4-D 2 mg/L與NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L和②6-BA 2.0 mg/L、2，4-D 2 mg/L與NAA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L等共10個(gè)處理，研究不同激素及濃度配比對(duì)綠絨海芋芽增殖的影響，以篩選出芽增殖效果最佳培養(yǎng)基。

1.2.4 ?生根培養(yǎng) ? 以1/2MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置IBA（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5）mg/L 5個(gè)處理，研究不同濃度的IBA對(duì)不定芽生根的影響。

1.2.5 ?培養(yǎng)條件 ? 以上培養(yǎng)基均添加3%蔗糖，瓊脂粉5.5 g/L，pH值調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度25（±2）℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度37～40 μmol/m2·s。

所有試驗(yàn)的每個(gè)處理不少于10瓶，并重復(fù)5次。外殖體每瓶接種一個(gè)，不定芽的繼代增殖及生根培養(yǎng)每瓶接種5～7個(gè)。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較分析（Duncan's）法。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?外殖體消毒效果

外殖體消毒效果如表1所示。葉柄外殖體在所有處理中的死亡率均為0，在處理4、處理8、處理9、處理10中的污染率為0，與其它處理差異顯著，綜合試驗(yàn)及觀察以0.1% HgCL2消毒8 min降低綠絨海芋葉柄外殖體污染效果較好;葉片外殖體在處理5、處理9、處理10中的污染率為0，與其它處理差異顯著，死亡率以處理7為最低，綜合污染率及死亡率考慮，葉片以0.1% HgCL2消毒7 min降低污染效果較好。

2.2 ?不同激素類型對(duì)離體葉柄、葉片愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化的影響

消毒后的外殖體接入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，45 d后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果如表2。6-BA與2，4-D的不同濃度組合，對(duì)綠絨海芋的外殖體葉柄和葉片愈傷組織誘導(dǎo)差異顯著。尤其是當(dāng)2，4-D的濃度大于2.0 mg/L時(shí)，差異明顯，其中葉柄作為外殖體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)100%（圖1-A），葉片作為外殖體時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率最高達(dá)98%。從愈傷形成所用時(shí)間來(lái)看，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，葉柄和葉片愈傷組織誘導(dǎo)的時(shí)間明顯短于6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)。從愈傷組織特點(diǎn)、形成時(shí)間、及出愈率3方面綜合看，以MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA為最佳培養(yǎng)基，差異明顯。

將光滑致密的愈傷組織轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果如表3。當(dāng)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D時(shí)，愈傷組織分化率為100%，與其它培養(yǎng)基組合差異顯著，當(dāng)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D時(shí)，平均芽數(shù)為16.01，與其它培養(yǎng)基差異顯著，是綠絨海芋最適合的分化培養(yǎng)基（圖1-B）。

2.3 ?不定芽的繼代增殖

將初代培養(yǎng)的不定芽切割成單芽以后，接入增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，25 d后增殖結(jié)果如表4。不定芽繼代增殖的結(jié)果因激素配比不同而異，以MS+2.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA增殖率最高（圖1-C），達(dá)17.36，其次為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，達(dá)15.40，MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA處理最低，僅為5.96。在所試驗(yàn)的激素濃度范圍內(nèi)，NAA的增殖倍數(shù)整體高于IBA，且不同濃度之間差異顯著。

2.4 ?不同激素濃度對(duì)不定芽生根的影響

將生長(zhǎng)健壯的不定芽切割成單芽后，接入生根培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表5。不同IBA濃度對(duì)綠絨海芋的不定芽生根有影響，生根率在濃度0.3 mg/L、0.4 mg/L、0.5 mg/L之間無(wú)差異，均達(dá)100%，與前兩個(gè)濃度之間差異顯著。綜合對(duì)比表5中各項(xiàng)指標(biāo)，以1/2MS+0.5 mg/L IBA為生根最優(yōu)培養(yǎng)基。

2.5 ?移栽

待苗生根20 d左右，大部分葉片增厚變硬時(shí)，從培養(yǎng)瓶中取出，由于小苗根部纏繞在一起，先以流水沖凈培養(yǎng)基再分開(kāi)小苗，移栽的基質(zhì)以蛭石 ∶ 珍珠巖（5 ∶ 1）、泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）或腐葉土 ∶ 蛭石（3 ∶ 1）為比例，在陰涼通風(fēng)處培養(yǎng)，溫度保持l8～20 ℃以上，每天需灑水或噴霧，成活率均可達(dá)到98%以上，但以泥炭土 ∶ 珍珠巖 ∶ 蛭石（3 ∶ 1 ∶ 1）中的苗生長(zhǎng)最為健壯（圖1-E）。

3 ?討論與結(jié)論

海芋屬植物離體培養(yǎng)的外殖體有花序[1]、塊莖[2]、根狀莖[3]、頂芽和側(cè)芽[5]、子球莖[6]和葉柄、葉片[7]。楊翠芹等[3]在海芋的預(yù)試驗(yàn)表明，葉柄與葉片培養(yǎng)不但誘導(dǎo)不出愈傷組織，且會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸死亡;Nguyen Thi Phuong Thao等[7]僅從葉柄誘導(dǎo)出愈傷組織，也沒(méi)有獲得葉片愈傷組織的成功。以綠絨海芋的葉柄、葉片作為外殖體，獲得成功的關(guān)鍵在于外殖體取材時(shí)間，以幼葉展開(kāi)5～10 d最好，太早幼葉太過(guò)幼嫩，消毒后易變黑死亡，即使不變黑也會(huì)先從周緣變黃或變褐，逐漸向中心部位擴(kuò)展，直至干枯死亡，部分黃化的葉片整體發(fā)白，失去活力;葉柄太嫩時(shí)，端部易變黃，甚至褐色，雖不至于干枯死亡，但影響愈傷組織形成時(shí)間和速度。同時(shí)以葉柄、葉片作為外殖體，相對(duì)于其它部位具有取材不受時(shí)間限制，不會(huì)破壞整個(gè)植株，而且接種量大的優(yōu)點(diǎn)。

2，4-D、6-BA、NAA、TDZ、KT等都被用來(lái)研究海芋屬愈傷組織的誘導(dǎo)與再生，葉柄、葉片愈傷組織誘導(dǎo)研究較少，即使有誘導(dǎo)率也較低。Nguyen Thi Phuong Thao等[7]以2，4-D與KT各0.5 μ/L的激素組合，用葉柄誘導(dǎo)愈傷組織，最高誘導(dǎo)率才達(dá)71%，且需暗培養(yǎng)4個(gè)月才誘導(dǎo)出愈傷組織。而本試驗(yàn)以葉柄、葉片為外殖體，在MS+2 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2，4-D+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最短8 d開(kāi)始產(chǎn)生愈傷組織，至45 d時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%。這可能與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的種類及濃度不同有關(guān)。

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