益腦康膠囊對缺血再灌注模型小鼠自噬相關因子Beclin-1、LC3B 和p62 的影響*

鄧敏貞，鐘曉琴，高志杰，彭麗霖，程 驍，孫景波△

1 廣東省中醫(yī)院/廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院/廣東省中醫(yī)藥科學院，廣東 廣州 510120；2 廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510006

腦卒中的病因主要是由于機體腦組織受到急性期或慢性期局部供血不足或供血中斷而引起的局灶性損傷，其中缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占80%，具有發(fā)病率高、致殘率高和致死率高等特點［1-2］。急性期IS西醫(yī)主要采用溶栓治療，具有局限性大和風險性高的特點，容易進一步引發(fā)缺血再灌注損傷，多數患者無法獲得滿意治療，如超過治療時間窗或嚴重肝腎功能不全等禁忌癥［3］。由于目前可以改善IS 患者腦循環(huán)的西藥較少，且毒副作用明顯；中醫(yī)活血化瘀類中藥具有改善腦循環(huán)作用，能整體調節(jié)患者機能，并有助于恢復患者的神經功能，可見中醫(yī)治療恢復期IS具有明顯優(yōu)勢［4］。

自噬具有各細胞成分更新功能，主要表現在降解及再循環(huán)異常的蛋白質或細胞器［5］。研究發(fā)現，生理狀態(tài)下，自噬具有雙向調節(jié)作用，一定程度的自噬可保護細胞生理功能，但腦缺血再灌注會過度激活自噬，嚴重者導致神經細胞死亡［6］。還有研究指出，抑制自噬可一定程度減少氧糖剝奪刺激作用下神經元的死亡［7］。益腦康是廣東省名老中醫(yī)劉茂才教授的經驗方，是治療動脈粥樣硬化性急性缺血中風的常用院內制劑［8］。研究證明益腦康膠囊具有促進微血管再生，抑制新血管生成，修復損傷的內皮細胞并調節(jié)其功能恢復和抑制炎性反應功能［9-10］。本研究通過觀察益腦康膠囊對腦缺血再灌注損傷小鼠腦組織及自噬相關因子表達的影響，探討益腦康膠囊防治缺血性中風的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物C57BL/6 小鼠50 只，雄性，SPF 級，體質量（20±2）g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK（粵）2018-0094，飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥科學院實驗動物中心，溫度（23±2）°C，相對濕度（45±5）%。小鼠適用性環(huán)境飼養(yǎng)3天后進行后續(xù)實驗。

1.2 藥物與試劑益腦康膠囊（廣東省中醫(yī)院院內制劑，批號：180804，規(guī)格：0.5 g/粒）；水合氯醛（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10232286，規(guī)格：100 g/瓶，純度≥99.0%）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國sigma 公司，貨號：T8877）；MCAO栓線（北京西濃科技有限公司，貨號：1620A4）；Trizol試劑（美國thermo公司，貨號：191012）；逆轉錄反應試劑盒（日本TAKARA 公司，貨號：RR047A）；擴增反應試劑盒（日本TAKARA 公司，貨號：RR086A）；肌球蛋白樣BCL2 結合蛋白（myosinlike BCL2 interacting protein，Beclin-1）、微管相關蛋白1的輕鏈3B（microtubule associated protein light chain 3B，LC3B）和泛素結合蛋白62（sequestosome 1，p62）ELISA 試劑盒（南京草本源生物科技有限公司，批號：07/2018）。

1.3 儀器ME403 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；T10 勻漿機（艾卡儀器設備公司）；5804R 冷凍離心機（德國艾本德公司）；EonC 全波長酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Nanodrop2000 超微量紫外/可見光光度計（美國Thermo 公司）；CFX96 熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 動物造模腦缺血再灌注損傷小鼠模型按照大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）法建立［11］。小鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射后仰臥位固定，對頸部手術部位進行備皮消毒，頸部正中切口，分離右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，頸總動脈暫時阻斷血流，然后將頸外動脈結扎并游離。在頸外動脈游離端處剪一小口，將MCAO 線栓由剪口處插入，經頸總動脈拐向頸內動脈的大腦中動脈起始處。栓塞1 h 后拔出線栓（栓塞期間注意小鼠保暖），結扎頸外動脈，形成缺血再灌注損傷模型，頸部切口處結扎縫合。假手術組小鼠按造模方法進行血管分離操作但不插入MCAO線栓。

1.5 分組與給藥造模結束小鼠蘇醒后，將神經評分不小于1 的小鼠隨機分為模型組及益腦康低（1 g/kg）、中（3 g/kg）、高（9 g/kg）劑量組，每組10 只，連續(xù)灌胃給藥3 天，每天2 次。假手術組和模型組小鼠（各10 只）給予等體積生理鹽水，連續(xù)3天，每天2次。

1.6 觀察指標

1.6.1 腦梗死體積 采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法，末次給藥結束后，小鼠麻醉過量致死，將腦迅速取出，置于預冷腦槽中以每片2 mm 厚度進行冠狀切片，將切片置于TTC 溶液中37 ℃浸泡30 min，每15 min 翻轉切片1 次，其中白色部分為腦梗死區(qū)域，正常組織染色為紅色。用照相機拍照后，再用Image J軟件進行分析。

腦梗死體積比例（%）=白色腦梗死體積/大腦體積×100%

1.6.2 神經損傷情況 末次給藥結束后對各組小鼠進行神經行為學評分［11］，評分標準：0 分行動自如，無明顯功能障礙；1 分造模對側前肢不能伸展，如握拳狀；2 分向健側旋轉圈，呈追尾狀；3 分行走身體傾倒；4分無行動欲望伴意識障礙。

1.6.3 Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA 和p62 mRNA表達 實時熒光定量聚合酶鏈式（real-time PCR，RT-PCR）法檢測半暗帶區(qū)域組織Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA 和p62 mRNA 表達。將各組小鼠的第2 個腦片半暗帶區(qū)組織，按100 mg 重量加入1 mL Trizol 比例提取總RNA。測量總RNA 濃度后，使用逆轉錄試劑盒在以下條件下合成cDNA：42 ℃ 2 min，溫度降至4 ℃取出。按擴增試劑盒操作在CFX96 PCR儀中進行RT-PCR，PCR反應條件：95 ℃ 1 min，40 個循環(huán)的95 ℃ 10 s 和60 ℃ 30 s。用2-△△Ct 數值表示目的基因相對表達量。引物序列由廣州真知生物有限公司設計與合成，引物序列：

Beclin-1：上游5'-GCTGTAGCCAGCCTCTGAAA-3'，下游5'-AATGGCTCCTGTGAGTTCCTG-3'，長度80 bp；

LC3B：上 游5'-GGGACCCTAACCCCATAGGA-3'，下游5'-TCTCCCCCTTGTATCGCTCT-3'，長度111 bp；

p62：上游5'-ACTGCTCAGGAGGAGACGAT-3'，下游5'-CCGGGGATCAGCCTCTGTAG-3'，長度77 bp；

β-actin：上游5'-CACTGTCGAGTCGCGTCC-3'，下游5'-CGCAGCGATATCGTCATCCA-3'，長度102 bp。

1.6.4 半暗帶區(qū)組織Beclin-1，LC3B和p62含量檢測 酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測半暗帶區(qū)組織Beclin-1，LC3B 和p62 含量。將各組小鼠第3 個腦片半暗帶區(qū)組織，按100 mg重量加入9 mL生理鹽水進行冰上勻漿，經離心半徑10 cm，3500 r/min 15 min 低溫離心后得上清液，按ELISA 試劑盒步驟操作，最后在450 nm處檢測各組吸光度。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠腦梗死（缺血區(qū)域）體積與假手術組比較，模型組小鼠缺血區(qū)域體積增加（P＜0.01）；與模型組比較，益腦康各劑量組小鼠缺血區(qū)域體積減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腦梗死（缺血區(qū)域）體積比例（±s）

表1 各組小鼠腦梗死（缺血區(qū)域）體積比例（±s）

注：與假手術組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

腦梗死（缺血區(qū)域）體積比例（%）組別鼠數劑量（g/kg）3.00±0.35 45.62±3.65**38.62±2.53**#30.60±2.06**##21.65±1.36**##假手術組模型組益腦康低劑量組益腦康中劑量組益腦康高劑量組10 10 10 10 10--1 3 9

2.2 小鼠神經損傷情況與假手術組比較，模型組小鼠神經損傷程度增加（P＜0.01）；與模型組比較，益腦康各劑量組小鼠神經損傷程度減少（P＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠神經評分（±s）

表2 各組小鼠神經評分（±s）

注：與假手術組比較，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

神經評分（分）0.00±0.00 3.20±0.16**2.00±0.11**#1.80±0.09**#1.40±0.10**##組別假手術組模型組益腦康低劑量組益腦康中劑量組益腦康高劑量組鼠數10 10 10 10 10劑量（g/kg）--1 3 9

2.3 小鼠半暗帶組織Beclin-1 mRNA、LC3B mRNA和p62 mRNA 表達與假手術組比較，模型組小鼠Beclin-1 mRNA 和LC3B mRNA 增加（P＜0.01），p62 mRNA減少（P＜0.01）；與模型組比較，益腦康各劑量組小鼠Beclin-1 mRNA和LC3B mRNA減少（P＜0.01），p62 mRNA增加（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠半暗帶組織Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA和p62 mRNA表達（±s）

表3 各組小鼠半暗帶組織Beclin-1 mRNA，LC3B mRNA和p62 mRNA表達（±s）

注：與假手術組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型組比較，#表示P＜0.05，##表示P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

組別假手術組模型組益腦康低劑量組益腦康中劑量組益腦康高劑量組p62 mRNA 1.03±0.04 0.30±0.03**0.42±0.03**#0.57±0.05**##0.84±0.08*##鼠數10 10 10 10 10劑量（g/kg）--1 3 9 Beclin-1 mRNA 1.02±0.51 12.32±1.55**7.67±0.46**##6.14±0.42**##4.27±0.50**##LC3B mRNA 1.00±0.11 10.58±0.61**6.33±0.60**##4.19±0.38**##2.34±0.19**##

2.4 小鼠半暗帶組織Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量與假手術組比較，模型組小鼠Beclin-1 和LC3B 蛋白含量增加（P＜0.01），p62 蛋白含量減少（P＜0.01）；與模型組比較，益腦康各劑量組小鼠Beclin-1和LC3B蛋白含量減少（P＜0.01），p62蛋白含量增加（P＜0.01）。見表4。

表4 各組小鼠半暗帶組織Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量（±s）

表4 各組小鼠半暗帶組織Beclin-1，LC3B和p62蛋白含量（±s）

注：**表示與假手術組比較，P＜0.01；##表示與模型組比較，P＜0.01；-表示等體積生理鹽水

組別假手術組模型組益腦康低劑量組益腦康中劑量組益腦康高劑量組p62（ng/g）90.56±5.50 21.29±2.75**36.11±1.95**##52.59±2.65**##64.43±3.47**##鼠數10 10 10 10 10劑量（g/kg）--1 3 9 Beclin-1（ng/g）8.54±0.65 43.04±2.76**30.23±1.35**##22.35±1.68**##15.12±0.74**##LC3B（ng/g）12.55±0.81 67.50±3.75**55.62±3.01**##43.46±2.53**##30.29±1.64**##

3 討論

腦卒中通常與嚴重神經功能下降和死亡率有關，其高致殘率為患者帶來了沉重的經濟和社會負擔［12］。IS 是腦卒中死亡的首要原因，其發(fā)病機制尚不明確［13］。中藥復方具有多靶點、多成分、多機制的特點，治療腦缺血具有較好的療效［14-15］。益腦康膠囊被列入國家科技部“十五”攻關課題“急性缺血中風辨證規(guī)范與療效評價的示范研究”中醫(yī)綜合方案［16］。但益腦康膠囊對腦卒中的作用機制尚不明確，因此本研究探討益腦康膠囊對IS 模型小鼠的作用機制。

中風事件大多歸因于大腦中動脈阻塞，最近研究說明較為理想的局灶性腦缺血模型是采用線栓法制備的小鼠局灶性腦缺血模型，有利于腦血管疾病的基礎研究［17］。TTC 是一種無色水溶性染料，主要在活細胞的線粒體中還原為深紅色水不溶性化合物（甲酰胺），用TTC 對新鮮腦切片進行浸沒染色是實驗性卒中模型中檢測梗死的一種簡單且流行的方法，可區(qū)分中風后的存活和梗死的腦組織［18］。本研究發(fā)現，模型組小鼠腦梗死體積較假手術組明顯增加，神經功能評分升高，提示造模成功。益腦康各劑量組小鼠神經功能評分較模型組減少，提示益腦康膠囊對IS 模型小鼠有較好保護作用。

自噬是維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的生理過程，其中Beclin-1 是自噬的調控基因和特異性基因，它是自噬啟動的關鍵因子，關鍵蛋白是LC3，具有控制自噬膜形成和自噬體與溶酶體融合的功能，LC3B 的產生是自噬的標志，能間接反映自噬程度與水平，其含量與自噬強度呈正相關［19-20］。p62是能在自噬溶酶體內發(fā)生降解可特異性識別泛素化的蛋白，研究發(fā)現其表達水平的高低與自噬水平呈負相關［21］。本研究表明，通過線栓法制備的局灶性腦缺血模型小鼠的Beclin-1 和LC3 表達增加，p62表達減少，提示IS自噬程度顯著增加。益腦康膠囊各劑量組小鼠Beclin-1 和LC3 表達減少，p62 表達增加，提示益腦康膠囊有一定減緩自噬激活的作用。

綜上所述，益腦康膠囊對IS 模型小鼠具有神經保護作用，其機制主要是抑制自噬過度激活，表現為減少Beclin-1 和LC3 表達及增加p62 表達。這可為益腦康膠囊的進一步臨床研究和基礎研究提供依據。