鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白對自由基的清除作用

馬華威　楊會成　吳一桂　金煜華

摘 要：采用胃蛋白酶從鮟鱇魚皮中提取膠原蛋白，分析胃蛋白酶酶溶性膠原蛋白的氨基酸組成和超微結(jié)構(gòu)，并研究體內(nèi)外清除自由基機(jī)理。結(jié)果表明：胃蛋白酶酶溶性膠原蛋白的超微結(jié)構(gòu)呈均勻網(wǎng)狀分布，是良好的藥物載體，體外清除自由基效果呈質(zhì)量濃度依賴性，當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，清除超氧陰離子自由基（O2-·）和羥自由基（·OH）能力最強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示其能顯著抑制小鼠皮膚中丙二醛生成，提高超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和羥脯氨酸含量，當(dāng)劑量為100 mg/（kg·d）時(shí)最好。提示該膠原蛋白具有體內(nèi)外清除自由基作用，其氨基酸組成、超微結(jié)構(gòu)與清除自由基能力有關(guān)，提取的鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白清除自由基活力接近于提取的膠原蛋白肽。

關(guān)鍵詞：鮟鱇魚；胃蛋白酶溶性膠原蛋白；自由基；清除作用

Abstract： The amino acid composition， ultrastructure and in vitro free radical scavenging activity and in vivo antioxidant activity of pepsin soluble collagen from Lophius litulon skin were investigated. The results showed that the pepsin soluble collagen could potentially be a good drug carrier due to its well-distributed network ultrastructure. The collagen exhibited scavenging activities against superoxide anion and hydroxyl free radicals in a dosage-dependent manner， reaching the highest activity at a concentration of 10 mg/L. In vivo experiments indicated that the collagen remarkably inhibited the formation of malondialdehyde （MDA） and hydroxyproline （Hyp） and the activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in mouse skin homogenate and the strongest inhibitory effect was observed at

100 mg/ （kg·d）. These findings imply that the pepsin soluble collagen has free radical scavenging activity both in vitro and in vivo comparable to that of the peptides derived from Lophius litulon skin collagen obtained in our previous study， which is associated with its amino acid composition and ultrastructure.

Key words： Lophius litulon； pepsin soluble collagen； free radical； scavenging effect

中圖分類號：Q936.16 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-8123（2015）09-0011-05

目前，公眾越來越重視減緩皮膚老化和改善皮膚狀況。氧自由基被認(rèn)為是導(dǎo)致皮膚老化的主要物質(zhì)，主要是低價(jià)還原分子氧產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧陰離子、過氧化氫、單線態(tài)氧。有報(bào)道稱，給ICR小鼠注射D-半乳糖8 周后能產(chǎn)生皮膚衰老[1-3]。D-半乳糖主要誘導(dǎo)ROS損傷由超氧化物歧酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶、親油基清除劑生育酚（tocopherol，VE）和親水基清除劑谷胱甘肽（glutathione，GSH）構(gòu)成的皮膚細(xì)胞內(nèi)源性防御系統(tǒng)[4-5]。另外，D-半乳糖導(dǎo)致皮膚老化與皮膚中羥脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量減少和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加有關(guān)[6]。D-半乳糖能使皮膚中Hyp含量減少、MDA生成量增加及SOD、CAT和GSH-Px活性受到抑制，造成皮膚細(xì)胞氧化損傷，最終導(dǎo)致色素累積，以及皮膚內(nèi)部結(jié)構(gòu)聯(lián)結(jié)、增厚，膠原纖維降解和彈性損傷，產(chǎn)生皺紋和皮膚老化[7]。有報(bào)道稱，從魚骨、魚皮中提取的膠原蛋白和明膠能抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠皮膚衰老[8]。本課題組之前對鮟鱇魚皮制備膠原蛋白肽及體內(nèi)外清除自由基活性進(jìn)行了報(bào)道[9-12]，也有研究者對鮟鱇魚皮制備膠原蛋白工藝報(bào)道[13-15]。但對鮟鱇魚皮胃蛋白酶溶性膠原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）清除自由基機(jī)理研究鮮少。

本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶從鮟鱇魚皮中提取酶溶性膠原蛋白，對該膠原蛋白的氨基酸組成和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，初步探討其體內(nèi)外自由基清除機(jī)理，并與本課題組之前提取的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽清除自由基活性進(jìn)行對比，以尋找出既在經(jīng)濟(jì)上節(jié)約又有較好活性的物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚皮由浙江海力生集團(tuán)有限公司提供，70 ℃冷凍保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)4 ℃解凍。昆明種小白鼠由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，體質(zhì)量23～25 g，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)動物合格證號SCXK（浙）20030001。

小牛皮膚膠原蛋白（calf skin collagen，CSC）

美國Sigma公司；胃蛋白酶（750 U/mg） 南寧龐博生物工程有限公司；Tris-HCl、發(fā)光氨、1，10-鄰二氮菲、鄰苯三酚、三氟乙酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；CAT、SOD、GSH-Px、MDA試劑盒 南京建成生物工程有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800PC光度計(jì)、WDD-2型電腦發(fā)光測試儀 生工生物工程上海（股份）有限公司；HITACHI 835-50氨基

酸分析儀、Micct-Q型超純水器、TM-100掃描電子顯微鏡 日本日立公司；JEOL JFC-1200精細(xì)鍍膜儀 西安景潤電子科技有限公司；DN-08C定氮儀、HH-4數(shù)顯恒溫水

浴鍋 上海尤尼珂儀器有限公司；透析袋 北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白提取[1]

所有步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行操作。剔除殘肉，去除非膠原蛋白殘余物，利用0.1 mol/L NaOH溶液抑制內(nèi)源性蛋白酶水解膠原蛋白，然后剪成4 cm×4 cm碎片，勻漿機(jī)破碎。依照料液比1∶15（m/V）溶于0.5 mol/L乙酸溶液，以20 U/g添加胃蛋白酶，不斷攪拌，48 h后三氟乙酸滅酶，雙層棉布過濾。剩余魚皮勻漿物在同等條件下重提過濾后，合并兩濾液，添加NaCl鹽析沉淀，離心獲得沉淀物。取上清液再次用NaCl沉淀離心，合并沉淀物。0.5 mol/L乙酸溶解沉淀物后，用5 000 D透析袋0.1 mol/L乙酸透析24 h，隨后蒸餾水透析12 h，滲析液冷凍干燥后即得鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白。參考美國分析化學(xué)家協(xié)會（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）蛋白、水分、灰分和脂肪評價(jià)方法[16]，分別測定新鮮鮟鱇魚皮、鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白的蛋白、水分、灰分和脂肪含量。計(jì)算蛋白含量以轉(zhuǎn)換系數(shù)6.25為基準(zhǔn)，通過相似性分析評價(jià)胃蛋白酶提取效果。

1.3.2 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白氨基酸組成分析

氨基酸分析前，膠原蛋白樣品先在120 ℃條件下用6 mol/L HCl 密封水解6 h，水解物經(jīng)蒸發(fā)后溶于30 mL檸檬酸緩沖液，然后取0.06 mL樣品用于氨基酸自動分析，以CSC作為對照。

1.3.3 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白·OH清除率測定[10]

分別取2.0 mL樣品液和1.0 mL 1.865 mmol/L 1，10-鄰二氮菲溶液加入密封真空管，混合均勻。吸管吸取1.865 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL添加入混合液中。以3∶13（V/V）的比率每次添加1.0 mL H2O2 進(jìn)行反應(yīng)。水浴鍋中37 ℃孵育1 h后，以H2O2為空白對照，在536 nm波長處測定吸光度。以不含有抗氧化物反應(yīng)混合液為陰性對照。按公式（1）計(jì)算膠原蛋白·OH清除率。

1.3.4 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白O2-·清除率測定[10]

分別取0.1 mL樣品液、850 ?L 1 mmol/L發(fā)光氨、50 ?L新配制的0.625 mmol/L鄰苯三酚在真空管中混合反應(yīng)。發(fā)光儀測定體系中的發(fā)光氨，以磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.8）作為空白對照。按公式（2）計(jì)算膠原蛋白O2-·清除率。

1.3.5 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白抗D-半乳糖誘導(dǎo)氧化活性的測定[10]

1.3.5.1 小鼠衰老模型建立及給藥

根據(jù)雌雄各半和體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分成4 組，每組10 只：模型組、正常組以及劑量組（低劑量組、高劑量組）。注射1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖給模型組、劑量組小鼠皮下。同時(shí)，低劑量組和高劑量組分別給鮟鱇魚皮膠原蛋白50、100 mg/（kg·d），飼喂量2 mL，正常組和模型組每天給予2 mL生理鹽水。在30 d實(shí)驗(yàn)中，所有的動物都允許水和標(biāo)準(zhǔn)飼料自由采食。

1.3.5.2 樣品收集

停藥次日取小鼠皮下組織，剪切成碎片后，4 ℃條件下用生理鹽水以1∶9（m/V）均漿制備混合液。經(jīng)3 000×g離心15 min后取上清液。上清液存儲在20 ℃。

1.3.5.3 樣品指標(biāo)測定

依據(jù)試劑盒要求測定小鼠背部皮膚均漿液SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量，依據(jù)比色法測定Hyp含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

除氨基酸組成分析數(shù)據(jù)外，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均測量3 次，最終數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）分析差異性。所有統(tǒng)計(jì)分析用Origin 7.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白產(chǎn)量及相似性分析

采用胃蛋白酶從鮟鱇魚皮中提取的膠原蛋白產(chǎn)量約11.33%，由表1可知，該膠原蛋白的蛋白含量約82.65%，比新鮮魚皮（25.11%）高，而脂質(zhì)（2.63%）、灰分（7.18%）和水分（7.54%）均較低。約63.49%灰分和79.8%脂質(zhì)從原材料魚皮中被去除，表明在胃蛋白酶添加量20 U/g、pH 2.0、4 ℃條件下提取24 h，能有效地提取出鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白。

2.2 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白氨基酸組成分析

由表2可知，鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白中Gly含量為344個(gè)氨基酸殘基/1000，Hyp含量為83個(gè)氨基酸殘

基/1000，低于對照蛋白。另外該膠原蛋白中Met、Hyl、Tyr、His含量較低，且Cys未檢測出，Arg、Glu、Phe、Leu、Ile分別占總氨基酸的5.2%、10.1%、0.8%、1.2%、1.8%。

2.3 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白超微結(jié)構(gòu)

鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白低壓冷凍后，超微結(jié)構(gòu)呈均勻疏松式纖維多孔狀結(jié)構(gòu)，如圖5所示。

2.4 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白體外自由基清除作用

由圖2可知，在2～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍，該膠原蛋白清除·OH和O2-·效果呈質(zhì)量濃度依賴性，質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對·OH和O2-·清除率分別是為70.16%和69.58%，均低于焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）和丁基羥基茴香醚（butyl hydroxy anisol，BHA），但高于VC，即BHA>TPP>PSC>VC，其中當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL清除自由基效果最強(qiáng)。

2.5 鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白體內(nèi)清除自由基作用

鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白對小鼠背部皮膚生化活性影響，由表3可知，灌胃100 mg/（kg·d）劑量D-半乳糖后，經(jīng)測試，小鼠皮膚組織的SOD、CAT、GSH-Px生化活性降低了16.2%、30.7%和31.3%，Hyp含量減少了30.5%，MAD含量增加了36.6%。與模型組比，低劑量組

（50 mg/（kg·d））（P<0.05）和高劑量組（100 mg/（kg·d））

（P<0.01）的SOD、GSH-Px、CAT活性水平顯著提高、Hyp含量增加、MDA含量降低。與50 mg/（kg·d）劑量組相比，100 mg/（kg·d）劑量組活性最佳。

3 結(jié) 論

近些年，鮟鱇魚成為世界重要經(jīng)濟(jì)漁種，通常在加工成鮟鱇魚片或魚丸制品后產(chǎn)生了大量不可食用魚皮、魚骨等副產(chǎn)物，往往被丟棄或作為低值飼料，不僅導(dǎo)致資源浪費(fèi)也造成環(huán)境污染。據(jù)報(bào)道，魚鱗、魚皮、魚骨等加工副產(chǎn)物中含有豐富的膠原蛋白，約占總蛋白30%[1]。與陸源動物膠原蛋白比，從海洋生物中提取膠原蛋白具有提取效率高、疾病傳播低、污染少、無宗教障礙限制等特點(diǎn)[2]。本實(shí)驗(yàn)提取的鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白的產(chǎn)量高于西班牙鯖魚皮膠原蛋白（3.49%）、大眼鯛魚皮膠原蛋白（6.4%）和褐斑紅鯛魚皮膠原蛋白（9.0%）[17]?？赡苁俏锓N、生物條件、組織組成和結(jié)構(gòu)、提取環(huán)境和方法的不同造成種類間膠原蛋白產(chǎn)量的差別[18]。酶解能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)破壞，使活性氨基酸殘基打開和暴露，通過還原自由基、螯合金屬離子阻斷脂質(zhì)過氧化或去除特定氧化劑等方式清除自由基[19]。鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白具有體外清除自由基的效果，可能是胃蛋白酶在提取過程中作用鮟鱇魚皮上的膠原蛋白分子，使活性氨基酸暴露，增大了與自由基分子反應(yīng)的概率。蛋白質(zhì)清除自由基作用與自身分子質(zhì)量大小和氨基酸組成有關(guān)[19]，而鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白清除自由基活性接近本課題組之前提取的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽，可推斷兩者清除自由基活性與分子質(zhì)量關(guān)系不大或之前提取的肽不夠純。這些現(xiàn)象表明，對鮟鱇魚皮膠原蛋白肽純化或多酶水解的進(jìn)一步研究有重要意義。另外，與之前提取的鮟鱇魚皮膠原蛋白肽相比，提取鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白不僅活性大小接近肽還節(jié)約了成本。

冷凍干燥是用于制備均勻多孔膠原蛋白的最有效手段。在軟骨植入和再生、傷口愈合治療過程中，膠原持水量、活性與孔徑大小相關(guān)[13，17]。該膠原蛋白均一規(guī)則的超微結(jié)構(gòu)似海綿，其清除自由基的活性可能與這一獨(dú)有結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，這一結(jié)構(gòu)不僅有利于促進(jìn)藥物均勻分布，也利于液體蒸發(fā)，孔徑可調(diào)，能夠作為藥物優(yōu)質(zhì)載體。

長期服用一定劑量的D-半乳糖使機(jī)體自由基和ROS增多，形成氧化應(yīng)激，導(dǎo)致SOD、CAT、GSH-Px活性和Hyp含量下降及MDA含量增加，最終造成各種皮膚細(xì)胞損傷[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給予昆明種小鼠1 000 mg/kg劑量的D-半乳糖能使小鼠皮膚老化，該衰老模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合Dae等[8]和本課題組之前的研究[10]，表明本實(shí)驗(yàn)所需小鼠皮膚衰老模型已成功構(gòu)建。有報(bào)道稱50、120、200、500、1 250 mg/kg劑量的D-半乳糖也能導(dǎo)致鼠皮膚老化[20]，可能是由于嚙齒類動物體質(zhì)量、年齡、營養(yǎng)狀況不同，導(dǎo)致了形成皮膚衰老的D-半乳糖劑量不同。

CAT、SOD、GPH-Px在體內(nèi)起到清除自由基的作用，主要是：CAT使體內(nèi)的過氧化物轉(zhuǎn)化成氧和水；SOD是抗氧化防御系統(tǒng)的守門員，催化O2-·轉(zhuǎn)變成過氧化物；GSH-Px有效地催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）清除過氧化物的反應(yīng)[20]。這3 種物質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的變化是考察物質(zhì)清除自由基活性強(qiáng)弱的常用指標(biāo)。灌胃鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白后，小鼠皮膚組織的SOD、CAT、GSH-Px活性顯著提高，初步表明該膠原蛋白具有體內(nèi)清除自由基作用。D-半乳糖誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)GSH氧化和泄漏也是致皮膚老化的原因[2]。據(jù)報(bào)道，GSH含有強(qiáng)活潑的巰基（-SH），在細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)中，作為重要自由基清除劑或輔助因子，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，游離的GSH能從還原型轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸停谶€原酶作用下又恢復(fù)還原型，阻止氧化反應(yīng)進(jìn)程[4]。與模型組比，灌胃鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白后，小鼠皮膚明顯狀況好轉(zhuǎn)，可能是該物質(zhì)提高了還原酶GSH-Px催化GSH清除過氧化物的活性。Hyp能穩(wěn)定膠原3 螺旋結(jié)構(gòu)，皮膚中Hyp含量減少，弱化了膠原3 螺旋結(jié)構(gòu)，引起皮膚褶皺[4]，因此Hyp含量也可作為考察藥物體內(nèi)清除自由基能力的指標(biāo)。該膠原蛋白的Hyp約占總氨基酸的8%，兩個(gè)劑量組均能顯著提高皮膚中Hyp的含量，說明該膠原蛋白通過補(bǔ)充Hyp量來改善皮膚外觀。MDA含量是考察脂質(zhì)過氧化的泛用指標(biāo)，其多寡表示皮膚老化程度[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，服用2 種劑量的膠原蛋白后小鼠皮膚中MDA含量減少，說明鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白通過與MDA作用阻止皮膚脂質(zhì)過氧化。

鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白Gly占氨基酸組成的34.4%，符合Gly是膠原蛋白主要氨基酸種類且占總氨基酸的33%以上的觀點(diǎn)[17]。膠原蛋白清除自由基作用與自身氨基酸組成有關(guān)，受氨基酸殘基種類、組成和序列影響，主要是Gly、Pro和疏水氨基酸承擔(dān)自由基清除作用[21]，

而這些氨基酸在鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白中含量較高，該膠原蛋白良好的清除能力可歸因于這一特有氨基酸組成。另外，由L-精氨酸、L-谷氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸按特定比率構(gòu)成的模式，也能夠有效地阻止皮膚老化[4]。鮟鱇魚皮酶溶性膠原蛋白能起到阻止皮膚衰老的作用，可能自身也有這一獨(dú)特的氨基酸模式。

參考文獻(xiàn)：

[1] KITTPHATTANABAWON P， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al. Isolation and characterization of collagen from the skin of brownbanded bamboo shark （Chiloscyllium punctatum）[J]. Food Chemistry， 2010， 119： 1519-1526.

[2] 林琳， 李八方. 魷魚皮膠原蛋白水解肽抗氧化活性研究[J]. 中國海洋藥物雜志， 2006， 25（4）： 48-51.

[3] XU F B. Sub-acute toxicity of D-galactose[C]//Proceedings of the Second National Conference on Aging Research. Harbin， 1985.

[4] HOU H， LI B， ZHAO X， et al. The effect of pacific cod （Gadus macrocephalus） skin gelatin polypeptides on UV radiation-induced skin photoaging in ICR mice[J]. Food Chemistry， 2009， 115： 945-950.

[5] RATNAM D V， ANKOLA D D， BHARDWAJ V， et al. Role of antioxidants in prophylaxis and therapy： a pharmaceutical perspective[J]. Journal of Controlled Release， 2006， 113： 189-207.

[6] WILLIAMS J Z， ABUMRAD N， BARBUL A. Effect of a specialized amino acid mixture on human collagen deposition[J]. Annals of Surgery， 2002， 236： 369-375.

[7] ZHONG S Z， GE Q H， QU R， et al. Paeonol attenuates neurotoxicity and ameliorates cognitive impairment induced by D-galactose in ICR mice[J]. Journal of Neurol Science， 2009， 277： 58-64.

[8] DAE Y Y， WOOSUK K， CHOOHG H L， et al. Melatonin improves D-galactose-induced aging effects on behavior， neurogenesis and lipid peroxidation in the mouse dentate gyrus via increasing pCREB expression[J]. Journal of Pineal Research， 2012， 52： 21-28.

[9] 楊會成， 鄭斌， 廖妙飛， 等. 鮟鱇皮膠原蛋白肽最佳制備工藝及自由基清除活性研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（20）： 159-165.

[10] 馬華威， 楊會成， 付萬冬， 等. 鮟鱇魚皮膠原蛋白肽的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)， 2014， 35（9）： 80-85.

[11] 馬華威. 雙酶分步酶解制備銨鱅魚皮膠原蛋白肽及牛物活性的研究[D]. 舟山： 浙江海洋學(xué)院， 2014.

[12] 東忠方， 閆鳴艷. 鮟鱇魚魚皮膠原蛋白多肽酶法制備工藝研究[J]. 食品工業(yè)， 2013， 34（3）： 87-90.

[13] 王珮， 蘇秀榕， 張永飛. 鮟鱇魚皮膠原蛋白酶提取最優(yōu)工藝研究與結(jié)構(gòu)表征[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34（7）： 217-223.

[14] 張虹， 卓素珍， 戴志遠(yuǎn). 鮟鱇魚皮中膠原蛋白的提取及性質(zhì)研究[J]. 中國食品學(xué)報(bào)， 2009， 9（6）： 34-51.

[15] 陳小娥， 方旭波， 鐘秋琴. 安康魚皮中膠原蛋白的提取工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技， 2007， 28（3）： 131-133.

[16] AOAC. Official methods of analysis of AOAC international[M]. USA： Association of Analytical Communities， 2000.

[17] LI Z R， WANG B， CHI Q F， et al. Isolation and characterization of acid soluble collagens and pepsin soluble collagens from the skin and bone of Spanish mackerel （Scomberomorous niphonius）[J]. Food Research International， 2013， 51： 283-289.

[18] JONGJAREONRAK A， BENJAKUL S， VISESSANGUAN W， et al. Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagens from the skin of Brownstripe red snapper （Lutjanus vitta）[J]. Food Chemistry， 2005， 93： 475-484.

[19] ELIAS R， KELLERBY S， DECKER E. Antioxidant activity of proteins and peptides[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition， 2008， 48（5）： 430-441.

[20] LIZAWA O， KATO T， TAMAGI H， et al. Long-term followup study of changes in lipid peroxide levels and the activity of superoxide dismutase， catalase and glutathione peroxidase in mouse skin after acute and chronic UV irradiation[J]. Archives of Dermatological Research， 1994， 286： 47-52.

[21] CHEN H M， MURAMOTO K， YAMAUCHI F， et al. Antioxidant activity of designed peptides based on the antioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1996， 44（9）： 2619-2623.