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    懷牛膝組織培養(yǎng)和快速繁殖體系的優(yōu)化

    2016-10-20 01:38:32劉穎李冬杰王沛沛
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年7期
    關(guān)鍵詞:快速繁殖懷牛膝組織培養(yǎng)

    劉穎 李冬杰 王沛沛

    摘要:為優(yōu)化懷牛膝(Achyranthes bidentata BL.)組織培養(yǎng)和快速繁殖體系,以懷牛膝莖段作為外植體,選擇MS為基本培養(yǎng)基,研究不同激素配比對(duì)組培快繁的影響。結(jié)果表明,3種激素對(duì)于外植體芽誘導(dǎo)中影響順序依次為6-BA>IBA>KT,最佳芽誘導(dǎo)優(yōu)化培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。誘導(dǎo)叢生芽增殖的培養(yǎng)基以MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT為最優(yōu),增殖系數(shù)達(dá)6.03。優(yōu)化生根培養(yǎng)以1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳,生根率最高,達(dá)95.1%。組培苗移栽至炭灰 ∶ 營養(yǎng)土 ∶ 蛭石(體積比1 ∶ 2 ∶ 1)的基質(zhì)中,成活率達(dá)到100%,且植株生長健壯。

    關(guān)鍵詞:懷牛膝;組織培養(yǎng);快速繁殖;優(yōu)化

    中圖分類號(hào): Q945.5;S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號(hào):1002-1302(2016)07-0083-04

    懷牛膝(Achyranthes bidentata BL.)屬莧科牛膝屬多年生草本植物,高70~120 cm,生長于河南沁陽、武陟、修武、溫縣一帶,為中國著名的“四大懷藥”之一[1]。其根呈圓柱形,直徑5~10 mm,土黃色;莖有棱角或四方形,綠色,有的還帶有紫色;葉片一般是橢圓形或是橢圓披針形,基部呈楔形或是寬楔形。懷牛膝因其根含皂苷元、齊墩果酸、蛻皮激素、牛膝多糖等有效成分,具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通血脈、降血壓、鎮(zhèn)痛、引藥下行和瀉濁通淋等功效[2],所以越來越受到人們的青睞,具有廣闊的開發(fā)利用前景。為了滿足市場需求,須要對(duì)其進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)栽培。近年來,對(duì)于牛膝的組織培養(yǎng)研究也有相關(guān)報(bào)道[3-5],但對(duì)于外植體選擇、激素配比及叢生芽分化上還存在一些問題[6-7]。本研究選取懷牛膝莖段為外植體,建立并優(yōu)化懷牛膝的組織培養(yǎng)及快繁體系,以期獲得最佳的組培條件,整體提高懷牛膝組培的效率,為其藥用成分的長期工廠化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試材料由河北科技大學(xué)植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供,以含有1~2個(gè)芽眼的懷牛膝2 cm幼嫩莖段為外植體。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 外植體處理 選取懷牛膝2 cm帶腋芽莖段,先用去離子水沖洗,再加入稀釋的洗潔精清洗,之后置于超凈工作臺(tái)上。用75%乙醇浸泡30 s,無菌水沖洗3次,然后用0.1%氯化汞消毒3 min,最后用無菌水沖洗3次,用消毒濾紙吸干水分,在無菌條件下,把消毒后的莖段切成0.5 cm 的小段待接種。

    1.2.2 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基(蔗糖3%、瓊脂0.8%,pH值為5.7~5.8),添加不同濃度的6-BA、IBA、KT,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表(表1),以篩選出最佳的激素組合,確定最佳的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將消毒處理后的外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,每種培養(yǎng)基中接種3個(gè),重復(fù)3次,置于培養(yǎng)室中,進(jìn)行培養(yǎng)并定期觀察不同外植體的誘導(dǎo)及分化情況,14 d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)外植體誘導(dǎo)出的叢生芽數(shù)。

    1.2.3 叢生芽增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 以MS為基本培養(yǎng)基(蔗糖3%、瓊脂0.8%,pH值為5.7~5.8),添加IBA 0.5 mg/L、KT 0.2 mg/L及3種不同濃度梯度的6-BA(表2),以篩選出最佳的6-BA濃度,確定最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基。切取1 cm長的單芽接種至3種增殖培養(yǎng)基上,每種培養(yǎng)基接種30個(gè),置于培養(yǎng)室中進(jìn)行增殖培養(yǎng),觀察叢生芽增殖及生長情況,25 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖系數(shù)(增殖系數(shù)=叢生芽分化的個(gè)數(shù)/叢生芽分化的外植體數(shù))。

    1.2.4 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 切取生長較粗壯的叢生芽接種于1/2 MS培養(yǎng)基 (蔗糖3%、瓊脂0.8%,pH值5.7~5.8) 上,并添加不同濃度的激素 (表3)進(jìn)行生根誘導(dǎo)培養(yǎng),每種培養(yǎng)基接種約30個(gè)叢生芽。觀察根的萌發(fā)及生長情況,統(tǒng)計(jì)根長、生根數(shù)和生根率(生根率=生根的組培苗數(shù)/接種的組培苗數(shù)×100%)。

    1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室的溫度為(25±2) ℃,光照強(qiáng)度為2 000 lx,光照時(shí)間為14 h/d。

    1.2.6 練苗與移栽的優(yōu)化 當(dāng)生根苗長至5 cm時(shí),置于溫室中揭去瓶蓋練苗4 d。然后用鑷子取出小植株,流水洗凈根部附著的培養(yǎng)基,移栽至苗床上,苗床基質(zhì)采用4種處理,分別為(1)草炭土;(2)營養(yǎng)土;(3)草炭土+營養(yǎng)土+蛭石(體積比1 ∶ 2 ∶ 1);(4)營養(yǎng)土+蛭石(體積比2 ∶ 1)。將移栽苗置于相對(duì)濕度80%~90%、溫度(25±2) ℃的環(huán)境中遮陰培養(yǎng)。培養(yǎng)期間,用1/2 MS的大量元素的營養(yǎng)液潤濕基質(zhì),觀察懷牛膝苗的生長情況,30 d后統(tǒng)計(jì)成活率,并比較生長狀態(tài)。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    利用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 外植體芽誘導(dǎo)的優(yōu)化

    將處理后的懷牛膝帶芽莖段分別接種于不同激素濃度組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,在相同條件下進(jìn)行離體培養(yǎng),比較不同激素濃度配比對(duì)外植體芽誘導(dǎo)的影響,正交試驗(yàn)結(jié)果見表4,方差分析結(jié)果見表5。

    從表4可以看出,試驗(yàn)中選取的3種激素,即6-BA、IBA、KT對(duì)懷牛膝外植體的誘導(dǎo)均具有影響。通過極差分析得出,3種激素對(duì)于叢生芽誘導(dǎo)的影響從強(qiáng)到弱依次為 6-BA>IBA>KT,3種激素最優(yōu)水平的組合是A2B1C2。方差分析結(jié)果表明,3種影響因素的不同水平之間均存在極顯著差異,3種激素的不同濃度配比對(duì)外植體的誘導(dǎo)具有極顯著的影響。

    在9種不同濃度的激素組合培養(yǎng)基中外植體芽的誘導(dǎo)和生長情況不同(表4、圖1)。接種在4號(hào)培養(yǎng)基中的外植體出芽數(shù)最高,平均達(dá)到3.25;4號(hào)培養(yǎng)基中外植體芽的生長狀態(tài)最好。培養(yǎng)7 d后,9種培養(yǎng)基中的外植體均于切口處萌發(fā)側(cè)芽,使其出現(xiàn)了啟動(dòng)現(xiàn)象。但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,不同培養(yǎng)基中的外植體芽生長情況出現(xiàn)了差異。5號(hào)、6號(hào)培養(yǎng)基中莖段基部愈傷組織生長旺盛,叢生芽數(shù)量少,而4號(hào)培養(yǎng)基中莖段的腋芽著生處膨大變綠,在切口處形成少量的綠色愈傷組織;并在莖節(jié)或莖尖端緊靠莖節(jié)上、下的部位分化出側(cè)芽,且生長旺盛;14 d形成叢生芽。

    結(jié)合正交試驗(yàn)分析結(jié)果及外植體芽誘導(dǎo)和生長情況,4號(hào)培養(yǎng)基的激素濃度配比為1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT,為懷牛膝外植體芽誘導(dǎo)的最佳激素配比方案。

    2.2 叢生芽增殖的優(yōu)化

    正交試驗(yàn)結(jié)果表明,影響懷牛膝叢生芽誘導(dǎo)分化的主要因素是6-BA,試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6-BA 3個(gè)不同濃度梯度的增殖培養(yǎng)基。將懷牛膝單芽接種至3種不同的增殖培養(yǎng)基中,觀察叢生芽的增殖及生長情況,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽的增殖

    系數(shù)及株高,比較不同6-BA濃度對(duì)叢生芽增殖的影響(表6)。結(jié)果表明,在Z2培養(yǎng)基中,即添加1.3 mg/L 6-BA時(shí),叢生芽的增殖系數(shù)最高,平均為6.03,叢生芽生長最快,且植株總體生長狀況最佳,整體表現(xiàn)均勻、壯實(shí),植株株高達(dá)4.12 cm(圖2)。培養(yǎng)基6-BA濃度增加1.5 mg/L或濃度減少至1.0 mg/L,叢生芽增殖系數(shù)和株高均偏低,且3種不同濃度的6-BA誘導(dǎo)叢生芽增殖的效果差異顯著。牛膝叢生芽增殖最適的6-BA濃度為1.3 mg/L,最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基為Z2,即MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。

    2.3 誘導(dǎo)生根的優(yōu)化

    選取生長健壯且長勢一致、高3~5 cm的叢生芽接入4種不同生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)。7 d可見根已長出,11 d根長可達(dá)約5 cm,根數(shù)最多達(dá)到8條,單芽長高變大,逐漸長成苗。從表7可以看出,在1/2 MS培養(yǎng)基中添加一定濃度的NAA或IBA都可以誘導(dǎo)懷牛膝叢生芽生根,但不同激素種類和濃度對(duì)生根誘導(dǎo)的影響不同(圖3)。多重比較分析結(jié)果顯示,4種不同生根培養(yǎng)基中叢生芽的根長、平均生根數(shù)、生根率均存在顯著差異。整體來看,在添加NAA的G1、G2培養(yǎng)基中,懷牛膝叢生芽生根速度慢,根粗且短,生根率低;而在添加IBA的G3、G4培養(yǎng)基中,叢生芽生根速度較快,生根率較高。在G4培養(yǎng)基中生根效果最好,生根率最高,為95.1%,并且生根速度快,根多而長,粗細(xì)適中。所以,懷牛膝叢生芽誘導(dǎo)生根的最佳培養(yǎng)基為G4培養(yǎng)基,即1/2 MS+0.5 mg/L IBA。

    2.4 組培苗練苗移栽的優(yōu)化

    懷牛膝生根苗經(jīng)過練苗4 d后移栽至4種基質(zhì)中,比較在不同的基質(zhì)中組培苗的生長情況,結(jié)果(表8)表明,懷牛膝的生根苗移栽至草炭灰 ∶ 營養(yǎng)土 ∶ 蛭石(體積比1 ∶ 2 ∶ 1)的基質(zhì)中成活率最高,達(dá)100%,且15 d后幼苗長出新葉(圖4),植株壯實(shí)。

    3 結(jié)論與討論

    植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物細(xì)胞的分裂、分化產(chǎn)生影響。一定濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長素對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)與增殖發(fā)揮著重要作用。不同激素濃度組合的正交試驗(yàn)及極差分析結(jié)果表明,3種激素對(duì)于叢生芽誘導(dǎo)的影響從強(qiáng)到弱依次為6-BA>IBA>KT,3種激素最優(yōu)水平的組合是A2B1C2。以此激素組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)懷牛膝外植體出芽數(shù)最多,平均值達(dá)3.25,并且外植體芽生長健壯、長勢好,綜合正交試驗(yàn)結(jié)果和外植體芽的誘導(dǎo)分化,篩選出懷牛膝外植體芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT。結(jié)果表明,細(xì)胞分裂素6-BA在叢生芽誘導(dǎo)中最為重要,它可以促進(jìn)細(xì)胞分裂,使芽分化,促進(jìn)萌發(fā)[8],特別是與一定濃度的生長素協(xié)同作用時(shí)會(huì)加速細(xì)胞分裂,加快叢生芽分化生長的速度。增加6-BA濃度,外植體的出芽數(shù)會(huì)增加,但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1.5 mg/L時(shí),外植體的出芽數(shù)呈減少的趨勢,外植體芽的誘導(dǎo)受到了抑制,本結(jié)論與劉堅(jiān)等的研究結(jié)果[9]一致,可能與試驗(yàn)材料自身生理特性及細(xì)胞分裂素和生長素的交互作用有關(guān)[10]。在叢生芽增殖誘導(dǎo)中,設(shè)計(jì)6-BA的3個(gè)濃度梯度[11],獲得最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+1.3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA+0.2 mg/L KT,增殖系數(shù)最高達(dá)6.03。

    生根過程起始于莖內(nèi)已分化潛伏的根原基,研究表明,生長素IBA和NAA對(duì)根的形成均發(fā)揮著重要作用。IBA可以促進(jìn)根原基的產(chǎn)生,激活不定根[12],加快不定根生長的速度,且形成的不定根細(xì)而長,在根與莖之間連接緊密,有利于組培苗大范圍吸收營養(yǎng)及水分。而NAA作用機(jī)理主要是為根的形成提供能源和碳源。通過不同濃度IBA、NAA的對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IBA在生根速度、生根條數(shù)及生根率上均優(yōu)于NAA。生根培養(yǎng)以培養(yǎng)基1/2 MS+0.5 mg/L IBA效果最佳,生根率最高,達(dá)95.1%,且每株組培苗平均生根數(shù)約為8條。

    栽培基質(zhì)是組培苗移栽成活的基礎(chǔ),在保水性能好且通風(fēng)透氣的栽培基質(zhì)中,組培苗成活率較高[13]。通過不同基質(zhì)的配比試驗(yàn)得出練苗后置于草炭灰 ∶ 營養(yǎng)土 ∶ 蛭石(體積比1 ∶ 2 ∶ 1)的基質(zhì)中,組培苗成活率可以達(dá)到100%,且植株生長健壯。

    本研究從外植體芽誘導(dǎo)、叢生芽增殖、叢生芽生根、組培苗練苗移栽4個(gè)階段優(yōu)化懷牛膝組織培養(yǎng)和快速繁殖體系,整體提高組培效率,為實(shí)現(xiàn)懷牛膝工廠化快速繁育奠定基礎(chǔ)。

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