豬傳染性胃腸炎病毒S基因在昆蟲細胞中的表達

武 岳，周金龍，張超林，張許科，*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，鄭州450002;2.國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南洛陽471003)

豬傳染性胃腸炎(Porcinetransmissible gastroenteritis，TGE)是豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)引起豬的一種嚴重腹瀉、嘔吐和脫水等主要臨床癥狀的高度接觸性傳染病，各種年齡的豬對該病均易感，其中2周齡以內(nèi)的仔豬死亡率高達100%，是威脅養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病毒性疾病［1］。近年來，該病有進一步流行的趨勢，尤其是冬季和早春寒冷季節(jié)常呈地方性暴發(fā)流行。且該病的臨床癥狀和流行病學與豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)、豬 輪 狀 病 毒(Porcine Rotavirus，PRV)、豬呼吸道冠狀病毒(Porcine respiratory coronavirus，PRCV)引起的疾病非常相似，傳統(tǒng)的血清學方法很難將其區(qū)分，這就大大增加了臨床診斷的難度，因此建立相應(yīng)的實驗室診斷方法勢在必行。

TGEV主要編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白，其中S蛋白攜帶主要的B淋巴細胞抗原決定簇，是唯一能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體和提供免疫保護作用的結(jié)構(gòu)蛋白。因此，S基因是TGEV基因工程疫苗研究的重要候選基因，S基因所表達的蛋白在決定病毒的親嗜性、致病性和血凝性等方面起著非常重要的作用［2－5］。研究表明，S 蛋白含有 A、B、C、D 4 個抗原位點［6］，在S蛋白的4個抗原位點中，A、B和D位點高度保守，A、D位點在誘導中和抗體的產(chǎn)生起著非常重要的作用［7］。其中，D位點在病毒的增殖過程中也起到一定的作用。另外，PRCV在基因組結(jié)構(gòu)上與TGEV具有較高的同源性［8］，TGEV S基因A抗原位點是TGEV和PRCV的保守序列［9］，而D位點在PRCV中缺失，可用于這兩種疾病的鑒別診斷。因此，本研究選擇了TGEV S基因編碼A、D抗原位點的片段進行了表達，以便為TGE診斷方法的建立提供物質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、菌株及細胞 TGEV毒株(ATCC?VR－1740TM)、Sf9細胞由國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 Bac－to－Bac?HBM －TOPO?Secreted Expression System kit、Cellfectin?II Reagent、Sf900 II SFM、HiPure Plasmid Miniprep Kit，Invitrogen公司;Viral Nucleic Acid Extraction kit，Geneaid;Reverse Transcriptase XL(AMV)、Prime STAR?HS DNA Polymerase，大連寶生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技有限公司;去糖基化酶PNGase F，NEB公司;DAB顯色試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司;HRP標記兔抗豬 IgG、FITC標記兔抗豬IgG，Sigma公司;豬傳染性胃腸炎陽性血清，美國VMRD公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的TGEV全基因序列(登錄號:EU074218)設(shè)計一對引物F和R。引物序列為:F:5’－ATGTCATTGAACACAACGGGT－3’;R:5’－TAAGCCACTAAGTAGC GTCCT－3’，擴增產(chǎn)物大小為1056 bp。引物由Invitrogen公司合成。

1.2.2 RT－PCR擴增目的基因 提取 TGEV的RNA，利用引物 R進行 cDNA的制備。然后以cDNA為模板擴增S基因編碼A、D抗原位點的片段。PCR反應(yīng)條件為:95℃預變性3 min;95℃變性30 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸 1 min，30 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。然后將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析，根據(jù)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書回收目的片段。

1.2.3 重組 Bacmid的獲得 根據(jù)Bac－to－Bac?HBM－TOPO?Secreted Expression System kit操作說明書，將回收產(chǎn)物直接克隆到pFastBacHBM－TOPO載體中，菌液PCR初步鑒定正確后，提取質(zhì)粒進行序列測定，測序正確的質(zhì)粒命名為pFast－S;然后將pFast－S轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細胞，經(jīng)三重抗性(卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素)藍白斑篩選后，利用試劑盒中提供的pUC/M13引物進行菌落PCR鑒定，然后提取質(zhì)粒，將陽性重組質(zhì)粒命名為Bacmid－S。

1.2.4 重組桿狀病毒的制備、擴增及鑒定 將獲得的重組質(zhì)粒Bacmid－S轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細胞，同時設(shè)置正常細胞對照。當細胞發(fā)生明顯病變時，收集上清液，即為P1代重組桿狀病毒。然后根據(jù)試劑盒說明書進行蝕斑實驗測定重組病毒滴度，按照MOI=0.1將P1代重組桿狀病毒［VML=(MOI×細胞總數(shù))/病毒滴度］接種到細胞密度為2×106/mL的Sf9細胞中，27℃培養(yǎng)至出現(xiàn)細胞病變?yōu)橹?，收集上清即為P2代毒。同樣的方法接種P2代毒，收集P3代毒，用于蛋白的表達。提取P3代重組病毒核酸，利用目的基因上下游引物F/R進行重組病毒的PCR鑒定。

1.2.5 重組桿狀病毒在Sf9細胞中的表達 將懸浮培養(yǎng)的Sf9細胞狀態(tài)調(diào)整至對數(shù)生長期后用于重組病毒的表達。接種前進行活細胞計數(shù)，將細胞密度調(diào)整至2×106/mL，按MOI=5接入P3代毒，同時設(shè)置正常細胞對照，置于27℃的搖床中，110 r/min培養(yǎng)48～72 h，收集上清。

1.2.6 間接免疫熒光(IFA)鑒定表達產(chǎn)物 在6孔細胞培養(yǎng)板上，將P3代重組桿狀病毒接種于預先長滿單層的Sf9細胞，培養(yǎng)至發(fā)生病變時用間接免疫熒光法(IFA)檢測重組蛋白的表達，具體步驟為:吸去細胞上清，用 PBS 液(0.01 mol/L、pH 7.4)洗滌細胞3次，用80%丙酮固定細胞20 min;然后用PBS洗3次，加入豬傳染性胃腸炎陽性血清37℃孵育1 h;再用PBS洗3次，加入FITC標記兔抗豬IgG 37℃孵育50 min，最后用PBS洗3次置于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.7 Western blot鑒定重組蛋白 將P3代重組病毒感染Sf9細胞，72 h后收集感染上清，同時收集正常Sf9細胞作為陰性對照進行SDS－PAGE電泳，用半干電轉(zhuǎn)移法將PAGE凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜上，進行Western blot鑒定。將轉(zhuǎn)印有蛋白的NC膜用封閉液4℃封閉過夜后，加入豬傳染性胃腸炎陽性血清(1∶200稀釋)37℃孵育1.5 h;PBST漂洗3次后，加入HRP標記的兔抗豬IgG(1∶2000稀釋)37℃孵育1 h;再用PBST漂洗3次后用DAB顯色試劑盒顯色2～3 min，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－PCR擴增目的基因 RT－PCR擴增S基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1056 bp左右的特異性條帶，與預期大小一致(圖1)。

2.2 重組Bacmid的鑒定 用pUC/M13引物對重組質(zhì)粒進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后在3556 bp處有一條電泳條帶，與預期結(jié)果相符，表明重組Bacmid構(gòu)建成功(圖2)。

2.3 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞 在轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin?ⅡReagent介導下，將重組質(zhì)粒 Bacmid－S轉(zhuǎn)染融合至95%的Sf9昆蟲細胞，72 h后在顯微鏡下觀察細胞病變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞腫大，細胞核增大，折光性增強，隨著感染時間的延長，細胞開始從底部脫落懸浮到培養(yǎng)基中(圖3A)，而正常Sf9細胞無此變化(圖3B)，表明重組病毒拯救成功。

圖1 S基因的PCR擴增結(jié)果

圖2 S基因重組Bacmid的PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細胞顯微觀察圖(200×)

2.4 RT－PCR鑒定重組病毒 提取P3代重組病毒的核酸，用目的基因上下游引物F/R進行RTPCR鑒定，電泳條帶為1056 bp，與預期目的基因大小一致。

2.5 IFA鑒定重組蛋白的表達 經(jīng)IFA鑒定，感染Bacmid－S的Sf9細胞中具有明顯的特異性熒光(圖4A)，而Sf9對照細胞沒有熒光(圖4B)，結(jié)果表明S蛋白在Sf9細胞中得到了表達。

圖4 S蛋白的間接免疫熒光鑒定結(jié)果

2.6 Western blot鑒定表達產(chǎn)物 轉(zhuǎn)印結(jié)果顯示，表達產(chǎn)物在蛋白分子質(zhì)量約為55 kD左右出現(xiàn)了一條特異性條帶(圖5A)，表明S蛋白在昆蟲細胞中得到了表達。用去糖基化酶PNGase F處理重組蛋白后，Western blot結(jié)果顯示在43 kD左右處出現(xiàn)了與預期理論值大小相符的條帶(圖5B)，表明昆蟲細胞對其表達的外源蛋白進行了糖基化修飾。

3 討論

目前，用于蛋白表達的系統(tǒng)很多。大腸桿菌等原核表達系統(tǒng)缺乏蛋白翻譯后加工修飾，影響其在診斷試劑抗原和疫苗制備等方面的應(yīng)用。酵母表達系統(tǒng)雖然能夠?qū)ν庠吹鞍啄苓M行糖基化修飾，但具有局限性［10］。而桿狀病毒表達系統(tǒng)對表達產(chǎn)物可以進行磷酸化、糖基化等一系列的翻譯后加工修飾［11］，另外桿狀病毒嚴格的宿主特異性，決定了它不能感染脊椎動物細胞，因此重組桿狀病毒不會對人和環(huán)境造成危害［12］，對畜禽無致病性［13］，在疫苗生產(chǎn)藥物開發(fā)等方面具有更好的應(yīng)用前景［14］。所以，桿狀病毒表達系統(tǒng)成為研究者們首選的真核表達系統(tǒng)［15］。

本研究采用Bac－to－Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，將含有A、D抗原位點的S基因片段直接克隆入pFastBacTMHBM－TOPO載體，經(jīng)轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)染后獲得重組桿狀病毒。與其它桿狀病毒表達系統(tǒng)如Bac－N－Blue系統(tǒng)相比，避免了重組病毒蝕斑篩選純化的步驟，大大縮短了重組病毒的產(chǎn)生周期。此外，pFastBacTMHBM－TOPO載體中含有蜂毒素信號肽序列，該序列為一分泌信號，保證了所表達的重組蛋白能夠有效的分泌到細胞外介質(zhì)中，這就增強了正確的二硫鍵的形成，同時降低了蛋白酶對表達蛋白的降解，還可以顯著減少雜蛋白的水平，簡化后期純化過程。

目的蛋白的表達水平除了受基因性質(zhì)的影響外［16］，還與轉(zhuǎn)染效率密切相關(guān)［17－18］。轉(zhuǎn)染細胞的種類、用于表達的細胞種類、接種病毒時細胞的生長狀態(tài)和密度、接毒劑量以及收毒時間等均可影響目的蛋白表達量。對轉(zhuǎn)染條件及表達條件進行優(yōu)化可獲得穩(wěn)定高效的表達。本研究采用能夠生產(chǎn)高滴度病毒的Sf9昆蟲細胞進行轉(zhuǎn)染，為了產(chǎn)生高滴度的重組病毒，本試驗選擇在250 mL或500 mL的三角瓶中懸浮培養(yǎng)昆蟲細胞，使懸浮細胞有更多的空間與病毒接觸，當細胞活率大于95%時調(diào)整細胞密度到2.0×106～2.5×106/mL進行重組蛋白的表達，接毒后細胞死亡率達到70% ～80%時收獲病毒液，發(fā)現(xiàn)此時收獲的病毒表達量最大。而且所表達的蛋白以可溶性的形式存在于感染細胞的上清中，為后期診斷抗原制備提供了方便和可行性。

Western blot顯示的條帶相對分子質(zhì)量(55 kD左右)比理論值(43 kD)偏大，經(jīng)糖基化位點預測軟件，目的蛋白含有10個N－糖基化位點，19個O－糖基化位點，可能是昆蟲細胞對其表達的外源S蛋白進行了糖基化修飾的結(jié)果［19－20］，因此增大了目的蛋白的分子量。本研究目的蛋白在昆蟲細胞中的成功表達，為TGE診斷抗原的研制及免疫預防的研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］殷 震，劉景華.動物病毒學［M］.第2版.北京:科學出版社，1997:681－690.

［2］Di－Qiu Liu，Xin－Yuan Qiao，Jun－Wei Ge，et al.Construction and characterization of Lactobacillus pentosus expressing the D antigenic site of the spike protein of transmissible gastroenteritis virus［J］.Canadian Journal of Microbiology，2011，57(5):392 －397.

［3］Abid Nabil Ben Salem，Chupin Sergei A，Bjadovskaya Olga P，et al.Molecular study of porcine transmissible gastroenteritis virus after serial animal passages revealed point mutations in S protein［J］.Virus Genes，2011，42(2):212 －219.

［4］Ortego Javier，Sola Isabel，Almazán Fernando，et al.Transmissible gastroenteritis coronavirus gene 7 is not essential but influences in vivo virus replication and virulence［J］.Virology，2003，308(1):13－22.

［5］Ballesteros L，Sanchez C，Enjuanes L.Two amino acid changes at N－terminus of TGEV spike protein result in the loss of enteric tropism［J］.Virology，1997，227(2):378 －388.

［6］Delmas B，Rasschaert D，Godet M，et al.Four major antigenic sites of the coronavirus transmissible gastroenteritis virus located on the amin o － terminal half of spike glycoprotein S［J］.Journal of General Virology，1990，71:1313－1323.

［7］Nogales A，Galán C，Márquez－ Jurado S，et al.Immunogenic characterization and epitope mapping of transmissible gastroenteritis virus RNA dependent RNA polymerase［J］.Journal of Virological Methods，2011，175(1):7－13.

［8］Kwon H M，Saif L J，Jackwood D J.Field isolates of transmissible gastroenteritis virus differ at the molecular level from the miller and purdue virulent and attenuated strains and from porcine respiratory coronavirus［J］.J Vet Med Sci，1998，60(5):589 －597.

［9］張春葉，孫英健，沈 紅，等.豬傳染性胃腸炎病毒S基因抗原位點B與C之間片段的克隆與原核表達［J］.中國獸醫(yī)科學，2008，38(6):510－513.

［10］Lakey D L，Voladri R K，Edwards K M，et al.Enhanced production of recombinant Mycobacterium tuberculosis antigens in Escherichia coli by replacement of low － usage codons［J］.Infection and Immunity，2000，68(1):233－238.

［11］凌 同，余 黎，白幕群.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究進展與應(yīng)用［J］.微生物學免疫學進展，2014，42(2):70－77.

［12］劉春菊，任煒杰，王志亮.桿狀病毒表達系統(tǒng)在獸用亞單位疫苗領(lǐng)域應(yīng)用的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40(9):101－104.

［13］孫新寬，宋麗麗，韋 平，等.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)在病毒性家禽疾病研究中的應(yīng)用進展［J］.中國家禽，2014，36(1):39－43.

［14］李晶梅.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)生產(chǎn)流感疫苗的研究進展［J］.中國獸藥雜志，2012，46(12):67－70.

［15］劉高強，章克昌，王曉玲，等.昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的研究與應(yīng)用進展［J］.中國生物工程雜志，2004，24(7):40－44.

［16］楊 雷，謝紅玲.共表達PRRSV GP5和N蛋白重組桿狀病毒的構(gòu)建與鑒定［J］.中國獸藥雜志，2013，47(12):13－16.

［17］秦志華，張明宇，張傳美，等.豬傳染性胃腸炎病毒纖突蛋白抗原表位區(qū)的表達及其免疫原性分析［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，50(7):22－24

［18］范學政，徐 璐，趙啟祖，等.豬瘟兔化弱毒E2基因重組桿狀病毒的構(gòu)建及抗體制備［J］.中國獸藥雜志，2015，49(1):6－9.

［19］李建強，柳紀省，程 杰，等.豬源冠狀病毒TGEV中國分離株纖突蛋白生物信息學分析［R］.生物技術(shù)通報，2009，4:95－98.

［20］Fandan Meng，Zeping Zhao，Guangxing Li.Bacterial expression of antigenic sites A and D in the spike protein of transmissible gastroenteritis virus and evaluation of their inhibitory effects on viral infection［J］.Virus Genes，2011，43:335 － 341.