β淀粉樣蛋白1～42促進(jìn)U87細(xì)胞凋亡作用的研究

申茉函 王全才

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧 沈陽 110004)

阿爾茲海默病(AD)又稱老年性癡呆，其主要病理特征是細(xì)胞外老年斑的形成和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)的集聚，而β淀粉樣蛋白(Aβ)是老年斑的主要成分，在老年斑的形成過程中具有神經(jīng)元毒性，其作用依賴于多肽的聚集狀態(tài)與蛋白濃度，主要的毒性片段是Aβ1～42，是AD的主要致病原因。本文通過MTT檢測(cè)代謝率，倒置顯微鏡、投射電鏡以及流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)研究Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的損傷作用機(jī)制，觀察其損傷細(xì)胞的途徑，討論AD的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 U87細(xì)胞(中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院);重組人β淀粉樣蛋白1～42(rhAβ1～42)本實(shí)驗(yàn)室制備并純化;DMEM培養(yǎng)基，自購自Gibco公司;Hoechst33342/PI染色試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司;流式細(xì)胞儀為美國BECTON DICKINSON公司生產(chǎn)的FACScan。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) U87細(xì)胞置于含10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%的胰酶消化后分瓶傳代。rhAβ1～42的處理，用10 mmol/L的HCl使其終濃度為100μmol/L，37℃孵育24 h。

1.3 MTT試驗(yàn) 細(xì)胞生長至約80%鋪滿表面時(shí)，以0.25%胰酶溶液消化，用含10%小牛血清的相應(yīng)培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整為6×106/ml。每孔100μl接種96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h，再向培養(yǎng)液中分別添加 0.5，1，5，10，20 和50 μmol/L的 Aβ1～42，每個(gè)濃度組復(fù) 4 孔，每孔加入 5 g/L 的MTT 20μl，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，每孔加入150μl的二甲基亞砜(DMSO)，充分振蕩使細(xì)胞溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測(cè)定各孔吸光度A值，計(jì)算U87細(xì)胞對(duì)藥的生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率(%)=〔1－實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值〕×100%。

1.4 形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長期的U87細(xì)胞，向培養(yǎng)液中加入10μmol/L的Aβ1～42，以未加者為對(duì)照組，培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察。

1.5 透射電鏡 Aβ1～42(10μmol/L)與U87細(xì)胞共培養(yǎng)，37℃孵育24 h后，對(duì)照組加入至與實(shí)驗(yàn)組等體積的培養(yǎng)液。收集細(xì)胞，PBS洗3次，離心，沉淀用4%戊二醛固定，4℃放置2 h。1%鋨酸在4℃固定1 h;棄去鋨酸培養(yǎng)液，PBS洗2次，每次20 min。0.5%醋酸雙氧鈾預(yù)染，室溫，搖床過夜。30%、50%、70%、90%、100% 梯度乙醇脫水各15 min，最后用100%乙醇脫水2次，每次10 min。Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)半薄切片定位后做超薄切片。1%醋酸雙氧鈾與檸檬酸鉛雙重染色。JEM-1200EX透射電子顯微鏡觀察，拍照。

1.6 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)和固定。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，濃度為 5×106/ml，分 5 組，Aβ1～42的終濃度分別為 10、20和50μmol/L，24 h后0.25%胰酶溶液消化、收集細(xì)胞、離心，PBS洗2次，按試劑盒說明書加入試劑Hoechst33342和PI，4℃避光孵育1 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞比率，使用CELL Quest軟件獲取細(xì)胞信息，Winmdi軟件分析細(xì)胞凋亡。每組設(shè)3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次，另設(shè)空白對(duì)照組。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以x±s表示。

2 結(jié)果

2.1 rhAβ1～42對(duì)U87細(xì)胞生長的影響 在0.5～50μmol/L的濃度內(nèi)，Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的生長抑制率明顯上升，細(xì)胞毒性作用顯著增強(qiáng)，說明隨著劑量的增大Aβ1～42對(duì)細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)更加明顯，特別當(dāng) Aβ1～42濃度≥10 μmol/L 時(shí)，Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的生長抑制率明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。見圖1。

2.2 投射電鏡觀察 正常對(duì)照組細(xì)胞表面有微絨毛，核大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體和高爾基體等結(jié)構(gòu)清晰可見(圖2A);而在實(shí)驗(yàn)組，加入10μmol/L rhAβ1～4224 h后，電鏡下可見細(xì)胞核移位、染色質(zhì)凝聚呈團(tuán)塊狀，胞質(zhì)相對(duì)較多，核小，核形相對(duì)規(guī)則，可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，擴(kuò)張形成池內(nèi)間隔(圖2B，2C)。

圖1 rhAβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的生長抑制率

圖2 投射電鏡觀察rhAβ1～42對(duì)U87細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

圖3 rhAβ1～42對(duì) U87 細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組凋亡率

2.3 rhAβ1～42對(duì) U87細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下觀察rhAβ1～4210μmol/L劑量組，在培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞間連接疏松、間質(zhì)變大，細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞脫落，與對(duì)照組比區(qū)分明顯。同時(shí)具有上述形態(tài)特征的細(xì)胞隨作用時(shí)間和濃度的增加而增多。見圖3。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的影響 見圖4，圖5。在Aβ1～42濃度為10、20和50μmol/L作用后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，10、20和50μmol/L劑量組的凋亡率分別為35.6%，42.2%，58.1%，明顯高于陰性對(duì)照組(P＜0.01)，且隨濃度呈正向依賴關(guān)系。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的作用

3 討論

科學(xué)研究表明，導(dǎo)致人類AD的主要物質(zhì)是Aβ。AD的診斷標(biāo)志是神經(jīng)元丟失、淀粉樣蛋白沉積物(老年斑)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)，其中老年斑的主要成分是 β 淀粉樣蛋白〔1，2〕，但還未被定義為AD的發(fā)病機(jī)制和病因。目前，在AD發(fā)病機(jī)制的眾多假說中，最受關(guān)注的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為，Aβ在AD發(fā)病過程中起著核心作用〔3，4〕，其引起的一系列神經(jīng)毒性作用是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能紊亂和死亡，引發(fā)癡呆的主要原因〔5～8〕，故本研究采用 Aβ 為研究對(duì)象。

APP是一種Ⅰ型膜蛋白，研究者對(duì)在AD腦中表達(dá)野生型APP的神經(jīng)病理學(xué)作用還不十分清楚。一些研究發(fā)現(xiàn)〔9〕由腺病毒介導(dǎo)的野生型APP695過表達(dá)在小鼠海馬部位時(shí)可導(dǎo)致神經(jīng)元的嚴(yán)重變性。在一些APP聚集的神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)激活的Caspase-3，呈現(xiàn)典型的凋亡樣特征，如大量的膜泡及DNA片段的形成。這些研究均提示內(nèi)源性APP在凋亡的神經(jīng)元內(nèi)可能被上調(diào)，它的過表達(dá)通過凋亡途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元變性。同時(shí)，作為Caspase-3介導(dǎo)的死亡通路中內(nèi)源性激活劑而促進(jìn)凋亡的發(fā)生。APP促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能還有〔10〕:①APP與Aβ結(jié)合通過誘導(dǎo)APP構(gòu)型發(fā)生改變(APP正常功能的喪失)，使APP具有毒性而啟動(dòng)細(xì)胞死亡;②APP通過與接頭蛋白Fe65和X11的結(jié)合或通過與G蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)原凋亡信號(hào);③過表達(dá)或突變APP明顯增加由谷氨酸介導(dǎo)誘導(dǎo)的原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元Ca2+濃度，APP錯(cuò)義突變將增強(qiáng)其原凋亡活性，使神經(jīng)元對(duì)各種凋亡刺激異常敏感;④APP過度在神經(jīng)元膜上積累，直接或間接地與神經(jīng)元特異通道及受體相互作用，可致神經(jīng)細(xì)胞的存活環(huán)境失去完整性，同時(shí)增加的Aβ對(duì)神經(jīng)元導(dǎo)致的毒性作用，共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

U87細(xì)胞屬于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與神經(jīng)元細(xì)胞有一定的相似之處。它廣泛應(yīng)用于研究離子通道、受體、遞質(zhì)分泌的實(shí)驗(yàn)中，也是研究神經(jīng)毒性常用的細(xì)胞株，用于研究多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病〔9～12〕。MTT代謝率實(shí)際上反映線粒體內(nèi)膜琥珀酸脫氫酶的活性，即反映線粒體的功能〔13〕，MTT代謝率降低。說明細(xì)胞存活率降低，本研究采用 MTT法，繪制不同濃度 rhAβ1～42對(duì)U87細(xì)胞生長曲線，結(jié)果說明隨著劑量的增大Aβ1～42對(duì)細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)更加明顯，特別當(dāng) Aβ1～42濃度≥10μmol/L時(shí)，Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的生長抑制率明顯高于對(duì)照組。倒置顯微鏡下觀察rhAβ1～4210μmol/L劑量組，在培養(yǎng)24 h后可見細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞間連接疏松、間質(zhì)變大，細(xì)胞皺縮，部分細(xì)胞脫落。而且具有上述形態(tài)特征的細(xì)胞隨作用時(shí)間和濃度的增加而增多。

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染法〔14〕。熒光染料Hoechst 33342能少許進(jìn)入正常細(xì)胞膜，使其染上低藍(lán)色，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst33342比正常細(xì)胞的多，熒光強(qiáng)度要比正常細(xì)胞中要高。此外，凋亡細(xì)胞的染色體DNA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而使該染料能更有效地與DNA結(jié)合，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst33342排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。PI染料不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。根據(jù)這些特性，用Hoechst33342結(jié)合PI染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為:正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色(Hoechst33342+/PI+)，凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst33342++/PI+)，壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。在Aβ1～42濃度為10、20和50μmol/L作用后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，各劑量組的凋亡率與對(duì)照組比較差異顯著，且隨濃度呈正向依賴關(guān)系。神經(jīng)病理學(xué)研究提示，與正常人相比，AD患者腦中神經(jīng)元的凋亡率要高出30～50倍，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為凋亡與壞死的發(fā)生有賴于藥物的劑量，相反意見認(rèn)為Aβ導(dǎo)致的細(xì)胞損傷完全是由于壞死途徑參與〔15～20〕。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Aβ1～42對(duì)U87細(xì)胞的損傷主要是通過凋亡途徑，我們認(rèn)為當(dāng) Aβ1～42濃度過大時(shí)，Aβ1～42對(duì) U87 細(xì)胞的損傷也可通過壞死途徑，盡管我們認(rèn)為凋亡是其主要的損傷途徑。

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