液相色譜法一次性檢測多種甜味劑的測定研究

王婷婷

摘 要：本文建立了同時測定六種人工合成甜味劑阿斯巴甜、糖精鈉、甜蜜素、安塞蜜、紐甜、甜菊糖甙的高效液相色譜分析方法，以Platicil ODS柱為分離柱，20mmol/L硫酸銨緩沖溶液（pH4.4）-乙腈為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器進(jìn)行檢測，整個分離過程在30min內(nèi)完成。樣品加標(biāo)回收率為85%～107%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%。該法可用于食品中六種甜味劑的同時測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；人工合成甜味劑；測定研究

一、前言

甜味劑是對能夠賦予食品甜味的物質(zhì)的總稱。由于糖精鈉（SA）、甜蜜素（SC）、安賽蜜（AK）、阿斯巴甜（ASP）、紐甜（NTM）、甜菊糖甙（S）等人工合成甜味劑具有高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點，因此在食品中被廣泛應(yīng)用。但過量使用會造成一定的毒副作用。例如甜菊糖甙可能有一定的致癌作用；阿斯巴甜可影響苯丙酮尿病患者的發(fā)育；長期食用糖精鈉會導(dǎo)致營養(yǎng)不良，其致癌可能性尚未完全排除；甜蜜素可能有致癌性，其代謝產(chǎn)物環(huán)己胺對心血管系統(tǒng)和睪丸有毒理作用。近年來發(fā)現(xiàn)有些商家對人工合成甜味劑的泛濫使用以及一些食品標(biāo)簽中未注明使用人工合成甜味劑，有些則以“糖蜜素”“甜味料”“蛋白糖”等混淆視聽，以掩蓋其產(chǎn)品的危害性，對消費者的身體健康構(gòu)成危害，嚴(yán)重侵犯了廣大消費者的利益。

二、實驗部分

1.儀器與試劑

Agilent HP1100高效液相色譜儀（配有四元梯度泵、在線真空退氣機、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器DAD，美國安捷倫科技有限公司），AS3120A超聲波振蕩器（奧特塞恩斯儀器有限公司），pHS-3E型精密pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Platicil ODS色譜柱，SIGMA 3K15離心機，BP211D電子天平（Sartorius），ProElut PXC固相萃取柱。糖精鈉（購置國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）、甜蜜素（Sigma公司產(chǎn)品）、安塞蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜均為Supelco公司產(chǎn)品，乙腈（色譜純），硫酸銨（優(yōu)級純）；其余試劑均為分析純；實驗用水為超純水系統(tǒng)制備。

2.色譜條件

色譜柱：ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為20mmol/L硫酸銨（用H3PO4調(diào)pH至4.4）-乙腈；梯度洗脫程序：乙腈：0～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為200nm，226nm；進(jìn)樣量為20μL。

3.樣品前處理

所有樣品均為市場采集的樣品，按照品種將其分為飲料、蜜餞、醬腌菜、酒類等，其中飲料按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步分為碳酸飲料、果汁、茶飲料、含乳飲料、植物蛋白飲料和固體飲料。

（1）介質(zhì)簡單的樣品。例如碳酸飲料、果酒、葡萄酒等，稱取10g樣品（精確至0.001g），置于25mL容量瓶中，用水定容（如有乙醇需水浴加熱除去乙醇后再用水定容至原體積）至刻度，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液待上機測定。

（2）介質(zhì)復(fù)雜的樣品。如茶飲料、果汁等，稱取6g樣品（精確至0.001g），置于25mL容量瓶中，用水定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液，以下操作按2.4。

（3）介質(zhì)為固體的樣品。例如蜜餞、醬腌菜等，將樣品粉碎，稱取2g樣品（精確至0.001g），稱取適量置于25mL，加水后并超聲振蕩20min，加水定容至25mL。4000r/min離心10min，取上清液，以下操作按2.4。

（4）含乳飲料和植物蛋白飲料。稱取6g樣品（精確至0.001g），置于25mL容量瓶中，依次加入2mL0.08mol/LK4[Fe（CN）6]（4.4）和2mL0.25mol/L乙酸鋅（4.5）溶液，劇烈振蕩2min，以沉淀蛋白質(zhì)，加水定容至刻度，4000r/min離心10min，取上清液，4000r/min離心10min，取上清液，以下操作按2.4。

4.試樣的凈化

取上清液3mL經(jīng)固相萃取柱（事先經(jīng)3mL乙腈活化，再用3mL水平衡）萃取。然后依次用3mL20mmol/L硫酸銨和3mL乙腈洗脫，收集洗脫液于10mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，濾液待上機測定。

5.測定

取處理液與混合標(biāo)準(zhǔn)使用液各20μL注入高效液相色譜分析儀進(jìn)行分離，以保留時間定性，峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量。

6.計算公式

樣品中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜含量（X）以毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）表示，按式①計算。其中糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜按200nm波長下的峰面積計算；安賽蜜按226nm波長下的峰面積計算：X=×C×K×…………式①。式中：X為樣品中糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿斯巴甜、甜菊糖甙、紐甜含量，單位為毫克每千克（mg/kg）或毫克每升（mg/L）；A2為樣品峰面積；A1為標(biāo)液峰面積；K為稀釋倍數(shù)；C為標(biāo)液濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；M為樣品質(zhì)量，單位為克（g）；V為樣品洗脫液濃縮定容體積，單位為毫升（mL）。

三、結(jié)果與討論

1.檢測波長的選擇

本實驗采用二極管陣列檢測器，在190～400nm范圍內(nèi)對所有分析物進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六種甜味劑的最大吸收波長分別為：糖精鈉204nm、甜蜜素194nm、安塞蜜226nm、阿斯巴甜202nm、甜聚糖甙200nm、紐甜206nm。選擇200nm波長對糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜進(jìn)行測定，選擇226nm波長對安塞蜜進(jìn)行測定。

2.流動相的選擇

應(yīng)為甲醇的截止波長為210nm左右，乙腈的截止波長為190nm左右，而糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜選擇在200nm出檢測。且乙腈的溶劑強度較高，粘度較小，故測定時選用乙腈。實驗考察了乙酸胺、硫酸銨、檸檬酸銨等溶液作為緩沖溶液是對分離度的影響，結(jié)果表明，乙腈-硫酸銨緩沖體系的洗脫效果最好。當(dāng)硫酸銨濃度分別為10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L時，20mmol/L、40mmol/L分離效果較好，且二者相差不大，考慮到緩沖鹽濃度增大，對色譜柱及系統(tǒng)管路造成的損害也會加大，所以選擇20mmol/L的硫酸銨最為緩沖鹽溶液。調(diào)節(jié)20mmol/L硫酸銨緩沖液的pH分別為3.0，4.0，4.4，5.0，6.0，在pH4.4條件下，六種甜味劑的色譜峰形和分離度良好。流動相配比對分離效果的影響實驗結(jié)果表明，當(dāng)硫酸銨緩沖液pH4.4，乙腈體積分?jǐn)?shù)小于8%時，幾種甜味劑均可實現(xiàn)基線分離，但阿斯巴甜和紐甜的保留時間比較長，峰形拖尾。隨著乙腈體積分?jǐn)?shù)的增大，所有分析物的保留時間均逐漸縮短。乙腈的體積分?jǐn)?shù)大于17%時，安塞蜜、糖精鈉和甜蜜素的色譜峰重疊，紐甜的保留時間大于40min。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形?？紤]到本實驗在短波長處測定，梯度增加太快會嚴(yán)重漂移，增加太慢分析時間就會加長，最終選擇的梯度洗脫程序為乙腈：0～2min，5%；2～30min，5%～50%；流速0.8mL/min。在此色譜條件下，6種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖如圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的色譜圖

3.線性范圍、精密度和檢出限

在實驗條件下，所有分析物的質(zhì)量濃度（mg/L）和峰面積（mAU）之間均有良好的線性關(guān)系，具體結(jié)果和檢出限（S/N=3）見表1.對混合標(biāo)準(zhǔn)品（糖精鈉、安塞蜜、阿斯巴甜、甜聚糖甙、紐甜均為40mg/L；甜蜜素80mg/L）平行測定6次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。

A：peak area response；C：concentration of analysis （mg/L）.

4.實際樣品的測定

（1）樣品中甜味劑含量的測定：在該實驗條件下，分別對5種樣品進(jìn)行了測定，結(jié)果見表2。

表2 實際樣品的測定結(jié)果（n=3）

（2）樣品加標(biāo)回收率的測定。取適量樣品，在線性范圍內(nèi)加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品做加標(biāo)回收實驗。每種樣品平行測定3次，測定結(jié)果見表3。平均加標(biāo)回收率在85%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.2%，測定結(jié)果令人滿意。

四、小結(jié)

本文通過對多種甜味劑高效液相色譜法的實驗分析，提出了適用于食品中多種甜味劑的檢測方法，以消除對商品中單一甜味劑檢測而造成其他甜味劑漏檢的可能性，同時減少同種食品多種甜味劑檢測時前處理的重復(fù)性，更加省時、快捷，也為質(zhì)檢、海關(guān)等部門凈化國內(nèi)外市場，保障食品安全提供更好的科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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