利用F2群體定位水稻谷粒長寬比QTL

馬孟莉，劉艷紅，江 玲，雷 恩，蘇一蘭，盧丙越*

(1．紅河學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/云南省高校農(nóng)作物優(yōu)質(zhì)高效栽培與安全控制重點實驗室，云南 蒙自 661100;2．南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球有超過50%的人口以稻米為主食，特別是亞洲地區(qū)［1］。水稻是我國第一大糧食作物，長期以來高產(chǎn)一直作為我國的水稻育種的主要目標，而忽視了稻米品質(zhì)的改良，在人民生活水平日益提高的今天，劣質(zhì)稻谷嚴重限制了其在國內(nèi)和國際市場的競爭力［2］。深入了解稻米品質(zhì)的遺傳規(guī)律，鑒定、定位相關(guān)基因/QTL及進一步精細定位和克隆，對加速利用分子標記輔助選擇改良水稻品質(zhì)具有重要意義。

粒型(粒長、粒寬、長寬比)是稻米外觀品質(zhì)的主要衡量指標。近年來，隨著DNA分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，國內(nèi)外研究者利用不同的群體定位到多個控制稻谷粒型的QTL，像GS3、GW5、GW2、Ghd7、GW8、GS5、qGL3 等控制粒長、粒寬的 QTL 先后被克隆(http://www．ricedata．cn/index．htm)，為揭示粒型的遺傳機理奠定了良好的基礎(chǔ)，而至今未見水稻長寬比QTL克隆的相關(guān)報道。已有研究表明控制水稻谷粒長寬比的QTL廣泛分布于12條染色體上，且不同的定位群體檢測到的長寬比QTL存在很大差異［3］，挖掘不同材料中控制谷粒長寬比的基因?qū)ι钊胙芯苛Ｐ偷倪z傳機制具有重要的意義。本研究以短粒粳稻品種南粳35和長粒秈稻N22構(gòu)建的F2代群體為材料，通過構(gòu)建遺傳連鎖圖譜挖掘控制水稻谷粒長寬比的QTL，為進一步的遺傳研究及育種利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材 料

南粳35/N22的F2群體184株及親本N22和南粳35。

1．2 方 法

1．2．1 材料種植和性狀調(diào)查 試驗材料于2009年正季種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土橋?qū)嶒炥r(nóng)場，5月17日播種，6月25日移栽，按照16．5 cm×23．5 cm的株行距種植親本及南粳35/N22的F2群體的184個單株，田間管理同大田生產(chǎn)。成熟期收獲親本和F2單株的種子，自然干燥后每個家系隨機選取10粒種子，3次重復(fù)，用游標卡尺測量粒長和粒寬，計算每粒種子的長寬比，以3次重復(fù)的平均值代表該家系的谷粒長寬比指標。

1．2．2 DNA提取及SSR分析 在分蘗期取親本及群體內(nèi)各株系的葉片1～2張?zhí)崛】侱NA。DNA的提取采用微量法，參照 Dellaporta等［4］的方法。待提取的 DNA樣品完全溶于 TE緩沖液后，用MBA2000UV/VS光譜儀測定其濃度。用雙蒸水將DNA樣品稀釋成20 ng/μL的工作液，作為PCR擴增反應(yīng)的模板。PCR 10 μL 反應(yīng)體系包括:10mmol/L Tris-HCl pH 8．3，50mmol/L KCl，1．5mmol/LMgCl2，50 μmol/L dNTPs，0．2 μmol/L 引物，0．5 U Taq polymerase和 20 ng DNA 模板。擴增反應(yīng)程序為 95 ℃5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1min，35個循環(huán);72℃ 7min。擴增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，然后用硝酸銀顯色，在堊白儀上讀取并記錄條帶。

1．2．3 QTL作圖及遺傳分析 連鎖圖譜的繪制由Lu等［5］完成。采用Windows QTL cartographer 2．5軟件［6］中的復(fù)合區(qū)間作圖法(CIM)進行標記與性狀間的關(guān)聯(lián)分析，在全基因組范圍內(nèi)檢測谷粒長寬比位點，及每個QTL可解釋表型變異的百分率。將Logarithm of odds(LOD)值2．5定為閾值，若標記區(qū)間LOD＞2．5，則以該區(qū)間LOD值最高處所對應(yīng)的位點為該性狀的1個QTL。按Stuber等［7］方法，根據(jù)顯性度(DR比值)來判斷每個QTL的基因作用方式。當DR≤0．2時，基因效應(yīng)為加性;當0．2＜DR≤0．8時，基因效應(yīng)為部分顯性;當0．8＜DR≤1．2時，基因效應(yīng)為顯性;當 DR＞1．2時，基因效應(yīng)為超顯性。同時用基于混合線性模型的QTLNetwork 2．0［8］軟件，以P=0．005為統(tǒng)計檢測閾值，對群體中的互作QTL進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2．1 親本南粳35與N22及F2群體的谷粒長寬比表現(xiàn)

親本N22和南粳35的平均谷粒長寬比分別為2．88和2．11，t檢測表明親本谷粒長寬比之間的差異達到極顯著水平(P≤0．01)。F2群體的谷粒長寬比介于1．94～3．00，平均為2．46;谷粒長寬比呈雙向超親分離，表現(xiàn)為近正態(tài)分布(圖1)，表明谷粒長寬比是由多基因控制的數(shù)量性狀，符合QTL作圖的要求。

2．2 谷粒長寬比QTL定位

利用Windows QTL cartographer2．5軟件在全基因組范圍對控制谷粒長寬比的QTL進行檢測。在第3、4和5染色體上共檢測到3個 QTL(圖 2)，LOD 值分別為6．10、2．62 和 21．81，貢 獻 率 分 別 為5．44%、4．97% 和 58．06%，qLWR-4增效基因來自南粳35外，qLWR-3和qLWR-5增加谷粒長寬比的基因均來自長粒型秈稻品種 N22(表1)，其中qLWR-5的LOD和貢獻率最大，來自N22的等位基因可以增加0．20的長寬比表型變異，為控制谷粒長寬比的主效QTL;基因作用方式分析表明qLWR-3為超顯性、qLWR-4為顯性、qLWR-5為部分顯性;利用QTLNetwork 2．0軟件沒有檢測到互作QTL。

圖1 南粳35/N22 F2群體谷粒長寬比分布頻率Fig．1 Frequency distribution of grain length-width ratio in Nanjing35/N22 F2 population

圖2 南粳35/N22 F2群體檢測的谷粒長寬比QTL在染色體上的分布Fig．2 The location of QTL for grain length-width ratio in Nanjing35/N22 F2 population

表1 南粳35/N22 F2群體檢測的谷粒長寬比QTLTab．1 QTL identified for grain length-w idth ratio in Nanjing35/N22 F2 population

3 結(jié)論與討論

水稻谷粒長寬比可以用來表示谷粒的形狀，是衡量稻谷外觀品質(zhì)的重要指標之一。通過不同親本構(gòu)建的群體定位結(jié)果不盡相同，表明不同水稻品種中控制谷粒長寬比的基因存在差異，研究不同品種長寬比的遺傳規(guī)律，將有利于充分揭示谷粒長寬比表型變化的大量基因座位，為相關(guān)基因分離及進一步克隆提供重要的信息。本研究利用長粒型秈稻品種N22和短粒粳稻品種南粳35構(gòu)建的F2群體對谷粒長寬比QTL進行定位，共檢測到3個控制谷粒長寬比的QTL，qLWR-5 LOD值為21．82，貢獻率接近60%，是控制谷粒長寬比的主效QTL，其鄰近的分子標記可用于分子標記輔助選擇育種。已有研究表明長寬比是多基因控制的數(shù)量性狀，以加性效應(yīng)為主，廣義遺傳率和狹義遺傳率均較高［3］，本研究中檢測到的3個QTL則表現(xiàn)為超顯性、顯性和部分顯性，與前人研究存在差異，可能是親本遺傳背景不同引起。本研究未檢測到上位性QTL對谷粒長寬比的影響，與譚耀鵬等［9］研究得出的谷粒外觀性狀受互作對的影響較小結(jié)果是一致的。

qLWR-3位于第3染色體短臂，與已克隆的GS3基因距離較遠［10］，而與Bai等［11］定位的qLWR3a和陳冰蠕等［12］定位的qlw3a位置相似，且對表型的貢獻率均在10%以內(nèi)，推測應(yīng)為同一QTL。本研究中qLWR-4定位在第4染色體長臂末端標記RM551和RM518之間，趙明芳等［13］利用單片段代換系在第4染色體長臂末端也檢測到一個控制谷粒長寬比的QTL qRLW-4，但與本研究的位置存在一定的偏差，是否屬同一位點還需進一步驗證。本研究中qLWR-5可以解釋58．06%的表型變異，是控制谷粒長寬比的主效QTL，分析發(fā)現(xiàn)該區(qū)間包含已克隆的控制粒寬基因GW5［14］和控制籽粒大小的基因GS5［15］，研究表明GW5編碼一個144氨基酸組成的核定位蛋白，通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)籽粒寬，而GS5編碼一個絲氨酸羧肽酶，該基因的高效表達能促進細胞分裂而增加細胞數(shù)目，使水稻籽粒增大，因此qLWR-5很可能與GW5或GS5等位，鑒于該位點對粒型的重要性，可在今后的水稻育種中加以利用。

［1］FAO．Statistical databases［DB］．Food and Agriculture Organization(FAO)of the United Nations，2004．

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