RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的研究

任 潔 盧建華

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型的研究

任 潔 盧建華

RANKL/RANK/OPG；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松；護(hù)骨素；MiR-503；腫瘤壞死因子-a

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后的婦女由于卵巢功能減退，雌激素不分泌或者分泌過少，骨吸收大于骨形成，形成高轉(zhuǎn)化型的骨質(zhì)疏松特點(diǎn)。臨床研究[1-2]發(fā)現(xiàn)：＞60歲的女性發(fā)病率高達(dá)24%，中老年女性診斷為骨質(zhì)疏松是男性的3倍。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型是通過切除動物的卵巢，造成雌激素分泌減少，來模擬PMOP。雌激素的減少破壞了骨吸收和骨形成的平衡，而RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)存在于骨吸收過程中，必然受到雌激素的影響。因此，本文主要針對RANKL/ RANK/OPG系統(tǒng)與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型的成果進(jìn)行研究，現(xiàn)綜述如下。

1 RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)

細(xì)胞核因子kB受體活化因子配體（the nucleus factor kB receptor activation factor ligands，RANKL），即破骨細(xì)胞分化因子，屬于TNF家族，發(fā)現(xiàn)于成骨細(xì)胞表面，為Ⅱ型跨膜蛋白。核因子kB受體活化因子（nuclear factor kB receptor activation factor，RANK）為Ⅰ型跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，存在于破骨細(xì)胞及其祖細(xì)胞表面，是RANKL的唯一靶信號受體。護(hù)骨素（osteoprotegerin，OPG）又稱骨保護(hù)蛋白，是一種可溶性的分泌型糖蛋白,屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，由成骨細(xì)胞合成和分泌。RANK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要3個(gè)單獨(dú)途徑[3-5]包括：①蛋白酶c-允un氨基末端激酶（c-允un N-terminal kinase，允NK）途徑，調(diào)節(jié)c-fos和c-jun（c-fos和c-jun是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬亮氨酸拉鏈家族成員）；②核因子kB（nuclear factor kB，NF-kB）途徑，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成和蛋白酶的產(chǎn)生；③絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt（又稱蛋白激酶B，protein kinase B，PKB）途徑，抑制凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排，可能與NF-kB途徑有交叉。

RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)作用于骨重建的骨吸收過程中。在骨吸收過程中，許多上游的細(xì)胞因子（如雌激素、糖皮質(zhì)激素、腫瘤壞死因子等）會影響成骨細(xì)胞分泌RANKL和OPG；此外存在于破骨細(xì)胞循環(huán)祖細(xì)胞—CD14+外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）上的小核糖核酸-503（mini ribonucleic acid-503，miR-503）能調(diào)控RANK表達(dá)[6]。當(dāng)RANKL作用于破骨細(xì)胞前體上的受體RANK時(shí)，觸發(fā)破骨細(xì)胞的成熟，并阻止破骨細(xì)胞的凋亡延長其壽命，從而誘導(dǎo)骨吸收。而OPG通過競爭性結(jié)合RANKL，從而減少RANKL與RANK結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞的分化成熟、誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。當(dāng)局部微環(huán)境中的RANKL/OPG濃度比升高時(shí)，破骨細(xì)胞的活躍度增加，引起骨密度的下降，造成骨質(zhì)疏松。

2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型

目前用于研究骨質(zhì)疏松癥的模型有許多種類，主要包括絕經(jīng)后、老年型、激素型、廢用型以及其它藥物誘導(dǎo)的模型。其中絕經(jīng)后的模型通過切除動物的卵巢（ovariectomized，OVX），從而引起雌激素的減少，來模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。對于動物的選擇，主要包括嚙齒動物、兔、羊、非人類靈長類動物等。1969年由Svallie首次建立了大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型。雌性大鼠在行卵巢切除術(shù)后，骨吸收大于骨形成，松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)化加快、骨量減少、骨強(qiáng)度下降，這種骨代謝的變化與早期絕經(jīng)后婦女相類似。楊林等[7]研究去勢大耳兔脊柱骨發(fā)現(xiàn)：去勢后3個(gè)月兔腰椎骨開始呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松表現(xiàn)，術(shù)后4個(gè)月可形成可靠的骨質(zhì)疏松模型。Liu等[8]采用OVX綿羊，并從切除卵巢后第四周開始按0.45mg/kg進(jìn)行肌注甲強(qiáng)龍，持續(xù)10個(gè)月，并在最后4周逐漸減少甲強(qiáng)龍的注射量，在卵巢切除12個(gè)月后腰椎BMD下降超過25%，成功構(gòu)建了骨質(zhì)疏松羊模型。1986年首次報(bào)道了使用非人類靈長類動物構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，靈長類動物在行OVX術(shù)9個(gè)月后進(jìn)行藥物干預(yù)治療，治療應(yīng)至少持續(xù)16個(gè)月[9]。OVX骨質(zhì)疏松模型主要是由于雌激素減少，影響骨吸收和骨形成的平衡，造成骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞，引起絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。但是，目前用于RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究的OVX骨質(zhì)疏松模型主要集中在鼠類模型上[10-13]。

3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)

絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松模型通過將動物的卵巢切除，造成雌激素分泌減少，引起骨吸收大于骨形成，從而構(gòu)建高轉(zhuǎn)化型的骨質(zhì)疏松模型。而RANKL/ RANK/OPG系統(tǒng)是骨吸收過程中一條重要的途徑，因此雌激素減少引起的骨質(zhì)疏松必然與之有一定的聯(lián)系。雌激素影響骨重塑主要通過2條途徑：一方面，雌激素通過與破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞上的雌激素受體（estrogen receptor，ER）結(jié)合，直接調(diào)節(jié)骨代謝[14-15]；另一方面，雌激素通過與ER結(jié)合，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞因子的分泌，如：OPG、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）、白細(xì)胞介素-1（interleukins-1，IL-1）、白細(xì)胞介素-6（interleukins-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-a（tumor necrosis factor-a，TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）。其中OPG和TNF-α參與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)，影響RANKL的表達(dá)。當(dāng)雌激素減少時(shí)，OPG分泌減少，RANKL/ OPG濃度比升高，RANKL與RANK結(jié)合增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化成熟，骨吸收大于骨形成，引起骨質(zhì)疏松。而此時(shí)TNF-α表達(dá)增加，TNF-α通過前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）誘導(dǎo)RANKL的表達(dá)并降低OPG的表達(dá)，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成、分化和成熟。此外，雌激素減少后，小核糖核酸miR-503在PBMCs上明顯減少，RANK表達(dá)增加，骨吸收活躍，引起骨質(zhì)疏松。以下是對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型與RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)在OPG、TNF-α及miR-503方面的相關(guān)的研究進(jìn)展。

3.1 OPG OPG對破骨細(xì)胞的形成具有決定性作用，可以作為骨量調(diào)節(jié)過程中的一個(gè)可溶性因子，并可用來治療破骨細(xì)胞增加相關(guān)的骨質(zhì)疏松癥[16]。而雌激素可以通過ER-α而不是ER-β影響成骨細(xì)胞產(chǎn)生OPG[17]。在相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究[18]方面，OVX組的大鼠與正常組相比，雌激素水平降低，OPG的基因表達(dá)減少，而RANKL基因表達(dá)增加，M-CSF無顯著差異，大鼠的中軸骨和四肢骨上的破骨細(xì)胞數(shù)增加以及骨密度下降。那么是否可以通過干預(yù)來促進(jìn)OPG的分泌，使RANKL/OPG濃度比降低，從而抑制雌激素減少引起的骨吸收。王強(qiáng)等[19]通過跑臺運(yùn)動來治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和去卵巢組比較,跑臺運(yùn)動組的OPG的mRNA表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；認(rèn)為力學(xué)刺激能通過促進(jìn)去卵巢大鼠骨組織中OPG的表達(dá)而發(fā)揮其抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的效果。Spilmont等[20]在研究石榴籽油（pomegranate seed oil，PSO）對OVX小鼠防止骨質(zhì)流失中發(fā)現(xiàn)含PSO血清直接或間接地增加成骨細(xì)胞分化和抑制破骨細(xì)胞形成，其中OPG轉(zhuǎn)錄水平顯著升高（達(dá)到治療前的4.4倍），RANK的表達(dá)顯著下調(diào)（0.51倍，P＜0.05）。Ma等[21]通過果糖二磷酸鍶鹽治療OVX大鼠，結(jié)果顯示，骨密度、骨微結(jié)構(gòu)及骨強(qiáng)度顯著改善，血清中的RANKL水平下降、OPG水平增加，骨髓中的RANKL基因表達(dá)減少、OPG基因表達(dá)增加。

但是也有報(bào)道[22-23]，隨雌激素水平降低，骨組織OPG的表達(dá)卻升高。推測可能雌激素水平突然降低，機(jī)體啟動應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，骨吸收和骨形成相互偶聯(lián)，骨重建代償性增加，從而引起OPG表達(dá)升高。

3.2 TNF-α 雌激素缺乏引起的骨質(zhì)流失中最重要的細(xì)胞因子是骨髓T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α[24]。雌激素通過影響TNF-α和IL-1，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，TNF-α抑制劑能顯著減少雌激素缺乏引起骨吸收增加的影響[25-26]。Roggia等[27]研究發(fā)現(xiàn)，①來自于切除卵巢小鼠的T細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生TNF的數(shù)量增加，引起RANKL的表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致破骨細(xì)胞形成；②卵巢切除術(shù)在野生型（wild type，WT）小鼠能快速誘導(dǎo)骨質(zhì)流失，而在TNF-/-小鼠上不行；③卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)流失，在T細(xì)胞缺陷的小鼠上沒有發(fā)揮作用，當(dāng)從WT小鼠移植T細(xì)胞則恢復(fù)骨質(zhì)流失，但是從TNF-/-小鼠上移植T細(xì)胞則不行。這些結(jié)果表明雌激素缺乏引起骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制是通過增加骨髓T細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而增加TNF的表達(dá)，引起RANKL的表達(dá)增加，促進(jìn)破骨細(xì)胞形成。那么是否可以通過增加雌激素來抑制TNF-α的表達(dá)？在實(shí)驗(yàn)研究方面，段永宏等[28]用選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑-雷諾昔芬治療去勢后大鼠，結(jié)果表明經(jīng)雷諾昔芬治療后的OVX小鼠骨小梁周圍及髓腔內(nèi)TNF-α陽性表達(dá)明顯減弱，接近假手術(shù)組水平；這表明雷諾昔芬起到了類似雌激素的保護(hù)作用，抑制了由TNF-α誘導(dǎo)而產(chǎn)生的骨吸收，減弱了因雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥。在臨床研究方面，劉景科等[29]通過青娥方治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松伴有骨痛患者，通過測定治療前后血清中的TNF-α，發(fā)現(xiàn)TNF-α水平降低，可抑制絕經(jīng)后代謝性骨丟失，促進(jìn)骨形成。

3.3 MIR-503 目前，對于小分子核糖核酸在破骨細(xì)胞形成和骨吸收方面的研究較少，而miR-503通過RANK調(diào)控破骨細(xì)胞形成。在OVX小鼠上，使用miR-503拮抗劑，抑制其表達(dá)，引起RANK蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)骨吸收、骨量減少；當(dāng)使用miR-503激動劑時(shí)，miR-503超表達(dá)，抑制骨吸收和骨量減少[6]。

4 展望

以上研究表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型通過卵巢切除，引起雌激素的缺乏，導(dǎo)致OPG、MIR-503表達(dá)降低和TNF-α表達(dá)增加，進(jìn)而影響RANKL/ RANK/OPG信號通路，最終促進(jìn)破骨細(xì)胞活化、分化、成熟以及阻止破骨細(xì)胞凋亡，快速誘導(dǎo)骨質(zhì)流失。目前用于RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究的OVX骨質(zhì)疏松模型主要集中在鼠類模型上。雌性鼠在行卵巢切除術(shù)后，骨代謝的變化與早期絕經(jīng)后婦女相類似：骨吸收大于骨形成，松質(zhì)骨的骨轉(zhuǎn)化加快、骨量減少、骨強(qiáng)度下降。因此，OVX骨質(zhì)疏松動物模型對于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模擬是可行的，并在RANKL/RANK/OPG信號通路上的研究也有一定進(jìn)展。但是雌激素的缺乏并不是僅僅通過RANKL/ RANK/OPG這一條通路引起骨質(zhì)流失，還可以通過雌激素受體等其它生物因子影響骨重塑，因此還有待進(jìn)一步研究。此外，基于OVX骨質(zhì)疏松模型的RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)方面研究在其他動物模型上有待進(jìn)一步開發(fā)。

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浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y206272）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（杭州 310053）

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