毛蕊異黃酮體外轉(zhuǎn)運研究及對多藥耐藥基因MDR1表達的影響

聶 根黃旭軍張信平徐江琳毛園清朱 真程時剛

毛蕊異黃酮體外轉(zhuǎn)運研究及對多藥耐藥基因MDR1表達的影響

聶 根1黃旭軍1張信平1徐江琳1毛園清1朱 真2程時剛3

目的 研究毛蕊異黃酮在體外模型Caco-2模型的轉(zhuǎn)運特征，及對多藥耐藥基因MDR1表達的影響。方法 采用MTT法確定毛蕊異黃酮對Caco-2模型作用的適用濃度范圍；考察濃度、pH、溫度及P-糖蛋白（P-gp）抑制劑（維拉帕米）和能量代謝抑制劑（疊氮化鈉）對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響；抑制多藥耐藥基因MDR1對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響。結果 從上層（AP）到下層（BL），毛蕊異黃酮的Papp＞10-6cm/s，表明吸收性良好；毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運與其濃度和時間呈正相關，4℃條件下毛蕊異黃酮的Papp與25、37℃下的Papp差異有統(tǒng)計學意義［AP→BL：（1.85±0.16）×10-6cm/s比（3.05±0.13）×10-6cm/s、（3.89±0.31）×10-6cm/s，P＜0.01；BL→AP：（1.94±0.29）×10-6cm/s比（3.49±0.18）× 10-6cm/s、（4.06±0.26）×10-6cm/s，P＜0.01］；pH=9時的Papp與pH=5、7.4時的Papp值差異有統(tǒng)計學意義［（1.13±0.16）×10-6cm/s比（3.46±0.32）×10-6cm/s、（2.72±0.26）×10-6cm/s，P＜0.01］。毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運不受MDR1基因的影響；毛蕊異黃酮的BL側到AP側和AP側到BL側的Papp比值＜1.5，不受能量代謝影響。結論 毛蕊異黃酮在Caco-2模型的轉(zhuǎn)運方式以被動擴散為主，不受P-gp和能量代謝的影響，且毛蕊異黃酮在低溫和堿性環(huán)境下不利于其吸收。

毛蕊異黃酮；Caco-2細胞模型；多藥耐藥基因；被動擴散

黃芪味甘性微溫，歸肺、脾、肝、腎經(jīng)；補氣固表，托瘡生肌；具有降低血液黏稠度、減少血栓形成、降低血壓、保護心臟、抗缺氧、抗腫瘤、增強機體免疫力作用[1]。黃芪所含黃酮主要有效成分毛蕊異黃酮，具有提高免疫功能,增強抗氧化、抗輻射和抗癌作用，保護心腦血管、肝臟、腎臟和肺臟作用，保護腦細胞，降血脂、降血糖、減少糖尿病并發(fā)癥等作用[2]。Caco-2（human colon androcarcinoma cell line）細胞模型是目前在國內(nèi)外廣泛應用的體外經(jīng)典吸收模型，可提供藥物透過小腸黏膜的吸收、轉(zhuǎn)運、以及毒性等信息，已獲得美國FDA批準用Caco-2細胞模型作藥物吸收篩選模型[3-4]。本課題研究毛蕊異黃酮在Caco-2細胞模型的轉(zhuǎn)運特性及其對多藥耐藥基因MDR1表達的影響，為毛蕊異黃酮藥動學特征研究提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑 毛蕊異黃酮（南京澤朗生物有限公司，批號141020）；二甲基亞砜（DMSO）、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶（含EDTA）、MTT（美國Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司）；High Pure RNA Isolation Kit、Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit（Roche公司）；超純水。

1.2 儀 器 SW-C允-2D凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司）；DMI4000B熒光倒置顯微鏡（德國徠卡公司）；Agilent 1200 series高效液相色譜儀（德國Agilent公司）；LDZ5-2型低速自動平衡離心機（北京立離心機有限公司）；全自動酶標儀（BIO-RAD）；Simplicity純水儀（美國Millipore公司）；Millicell-ERS電阻儀（美國Millipore Corporation公司）；6、24、96孔細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（美國Corning公司）；24孔Millicell轉(zhuǎn)運孔（0.4μm，美國Millipore Corporation公司）；熒光定量PCR儀（BIO-RAD）；Eppendorf移液槍。

1.3 細 胞 Caco-2細胞，購自中國科學院上海細胞庫，第25代。

2 實驗方法

2.1 Caco-2細胞單層模型建立[5-6]將Caco-2細胞接種于6孔板并用DMEM高糖培養(yǎng)基（含20%胎牛血清、1%非必需氨基酸）在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天換液。當細胞生長至70%～80%的孔面積，傳代。以1×105cells/mL的細胞濃度接種于Transwell小室中，上層（AP）與下層（BL）分別加0.5、1.5mL培養(yǎng)基，隔天換液，培養(yǎng)至21天左右，測定各孔跨膜電阻值＞500Ω·cm2，表明Caco-2細胞單層已形成，可以用于以下實驗。

2.2 MTT法確定藥物安全濃度 將Caco-2細胞以1×105cells/mL細胞濃度接種于96孔板，在37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，吸盡96孔板各孔培養(yǎng)液，加入濃度分別為20、40、80、120、160、200、300、400、600mg/L的毛蕊異黃酮溶液，空白對照孔加入空白培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，各孔加5mg/mL的MTT溶液20μL，37℃下孵育4h。棄上清液，各孔加DMSO 180μL，振蕩溶解結晶物，酶標儀490nm檢測吸光度A值，空白調(diào)零，計算細胞存活率。取細胞存活率≥95%的毛蕊異黃酮濃度作為細胞安全濃度。

2.3 轉(zhuǎn)運實驗 取符合條件的Transwell孔，用37℃預熱的Hanks液洗3遍，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中溫孵30min，棄Hanks洗液。用Hanks液配制濃度為50、100、150mg/L的毛蕊異黃酮藥液。在AP側→BL側，AP側分別加毛蕊異黃酮各濃度藥液0.5mL，BL側加Hanks液1.5mL；在BL側→AP側的轉(zhuǎn)運中，AP側加Hanks液0.5mL，BL側分別加毛蕊異黃酮各濃度藥液1.5mL。將轉(zhuǎn)運孔板置于37℃、50r/min的恒溫搖床上，于30、60、90、120min時間點從未加藥側取樣200μL，同時補充相應體積的空白Hanks液，樣品采用HPLC檢測。

P糖蛋白（P-gp）抑制劑維拉帕米和能量代謝抑制劑疊氮化鈉對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響：分別用45mg/L維拉帕米和600mg/L疊氮化鈉的Hanks液將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育30min，棄廢液，分別加100mg/L中濃度藥液進行轉(zhuǎn)運實驗。

pH對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響：Hanks液蕩洗轉(zhuǎn)運孔后，在AP側加入pH=5、7.4、9的100mg/L中濃度藥液進行轉(zhuǎn)運實驗。

溫度對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運影響：37℃預熱的Hanks液洗所有轉(zhuǎn)運孔，加100mg/L中濃度藥液，分別置于4℃、25℃和37℃搖床中進行轉(zhuǎn)運實驗。

2.4 毛蕊異黃酮HPLC測定方法 色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18（規(guī)格：150mm×4.6mm，5μm）；流動相乙腈-水（30∶70）；體積流量1mL/min；檢測波長260nm；柱溫35℃；進樣20μL。,

2.5 樣品處理方法 樣品12 000r/min離心15min，取上清，HPLC檢測。

應用到肉制品中替代硝鹽發(fā)色作用的多為天然色素，主要的為如紅曲紅、焦糖色素、亞硝基血紅蛋白色素、番茄紅素、植物提取物等，但其機理是上色，而能否作為替代物的關鍵為其色度和穩(wěn)定性。

2.6 RT-PCR檢測MDR1基因mRNA 引物序列MDR1（F）：5’-GCCTGGCAGCTGGAAGACAAATAC-3’；MDR1（R）：5’-ATGGCCAAAATCACAAGG GTTAGC-3’。β-actin（F）：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’；β-actin（R）：5’-CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA-3’。

將Caco-2細胞分為不加藥對照組、45mg/L維拉帕米陽性對照組和100mg/L毛蕊異黃酮組，給藥后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h。參照Transcrptor First Stand cDNA synthesis kit說明書：融解試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。在RNA-Primer Mix反應管中分別加入以下試劑：總RNA 2μL，Anchored-oligo（dT）18 primer 1μL，Water（PCR-grade）10μL，Transciptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer 4μL，Protector RNase Inhibitor 0.5μL，Deoxynucleotide Mix 2μL，Transciptor Reverse Transcriptase 0.5μL，終體積20μL。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心混勻。反應條件設置為55℃反應30min。反應結束后，85℃滅活處理5min，至冰上冷卻，然后將cDNA樣品放入-20℃下保存待用。

參照2×All-in-OneTM Q-PCR Mix說明書：融解試劑，上下輕微顛倒混勻，短暫離心后放置冰上待用。分別加入以下試劑：上游引物1μL，下游引物1μL，2×All-in-OneTM Q-PCR Mix10μL，F(xiàn)irst strand cDNA 2μL，ddH2O 6μL，終體積20μL。充分混勻反應液，封好熱封膜，短暫離心，使所有試劑都甩至反應管底部。PCR條件為：起始94℃3min，擴增時94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 30s，擴增35個循環(huán)，并在65℃～95℃之間繪制溶解曲線。以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)Bio-rad檢測系統(tǒng)提供的Ct值，通過相對定量法（2-△△Ct法）計算MDR1mRNA表達水平，進行PCR擴增產(chǎn)物的實時定量分析。

2.7 統(tǒng)計學方法 表觀滲透系數(shù)Papp值（計算公式如下）作為參考，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)均以（±s） 表示，應用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，不同組間兩兩比較采用LSD（最小顯著性法）單因素方差分析（One-Way ANOVA）。Papp=（dQ/dt）（/A·C0）（注：dQ/dt為單位時間藥物轉(zhuǎn)運量，A為Caco-2細胞膜表面積，C0為初始給藥物濃度）。

3 實驗結果

3.1 Caco-2細胞培養(yǎng) 細胞接種于6孔板上，生長12、24、48、96h，顯微鏡觀察結果發(fā)現(xiàn)細胞接種后12h就開始貼壁，隨著培養(yǎng)時間延長，細胞生長均勻，邊界清晰，培養(yǎng)48h后，貼壁70%以上，培養(yǎng)96h后細胞長滿6孔板，并有部分開始死亡浮起，見圖1（封二）。

3.2 毛蕊異黃酮安全給藥濃度 MTT法計算細胞給藥后存活率，毛蕊異黃酮在20～160mg/L濃度范圍時細胞存活率在95%以上，確定毛蕊異黃酮對Caco-2細胞的安全給藥濃度范圍。

3.3 毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運與濃度的關系 在同一時間，毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運量與濃度呈正相關。BL→AP與AP→BL的 Papp均無顯著性差異，PappBL→AP/PappAP→BL均＜1.5，可推斷毛蕊異黃酮以被動擴散為主，見表1、圖2（封二）。

表1 毛蕊異黃酮在Caco-2細胞模型轉(zhuǎn)運特性（±s）

表1 毛蕊異黃酮在Caco-2細胞模型轉(zhuǎn)運特性（±s）

濃度（mg/L）50 100 150 Papp（×10-6cm/s）孔數(shù)333 AP→BL 2.32±0.41 3.11±0.36 3.90±0.67 BL→AP 2.85±0.86 3.35±0.87 4.10±0.85 PappBL→AP/PappAP→BL 1.23 1.08 1.05

3.4 pH對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響 在介質(zhì)pH分別為5、7.4、9的條件下，給藥3h后，測定毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運量得到Papp分別為（3.46±0.32）、（2.72±0.26）、（1.13±0.16）×10-6cm/s，介質(zhì)條件pH=9時，藥物的Papp較pH5和7.4顯著降低（P＜0.01），毛蕊異黃酮在堿性環(huán)境下不利于吸收轉(zhuǎn)運。見圖3（封二）。

3.5 溫度對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響 溫度影響蛋白的活性，可能影響藥物在Caco-2細胞模型上的轉(zhuǎn)運。在轉(zhuǎn)運環(huán)境4、25、37℃時，毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運率Papp值差異均有顯著差異，可見毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運受溫度影響。見表2。

表2 溫度對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響（±s）

表2 溫度對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響（±s）

注：4℃、25℃、37℃兩兩比較，▲P＜0.01，△P＜0.01

溫度（℃）4 25 37孔數(shù)Papp/（×10-6cm/s）333 AP→BL 1.85±0.16▲3.05±0.13▲3.89±0.31▲BL→AP 1.94±0.29△3.49±0.18△4.06±0.26△PappBL→AP/PappAP→BL 1.05 1.14 1.04

3.6 抑制劑維拉帕米與疊氮化鈉對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響 Caco-2細胞中P-gp是多藥耐藥基因調(diào)控的外排蛋白，而維拉帕米是P-gp抑制劑。疊氮化鈉是非選擇性的藥物吸收的能量抑制劑，影響細胞的能量代謝。在加入維拉帕米和疊氮化鈉共孵育30 min后，與未加抑制劑組進行各組毛蕊異黃酮Papp比較，結果顯示無顯著差異，說明毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運不受轉(zhuǎn)運蛋白P-gp和能量消耗影響，見表3。

3.7 Rt-PCR檢測MDR1基因表達 與對照組比較，45mg/L維拉帕米對MDR1表達有顯著的下調(diào)作用（P＜0.01），毛蕊異黃酮對MDR1表達沒有影響，實驗表明毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運不受P-gp的影響，見表4。

表3 抑制劑對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響（±s）

表3 抑制劑對毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運的影響（±s）

組別毛蕊異黃酮毛蕊異黃酮（維拉帕米處理）毛蕊異黃酮（疊氮化鈉處理）孔數(shù)Papp/（×10-6cm/s）333 AP→BL 3.11±0.64 2.92±0.43 3.08±0.24 BL→AP 3.36±0.86 3.29±0.51 3.14±0.31

表4 MDR1基因mRNA在各組表達（±s）

表4 MDR1基因mRNA在各組表達（±s）

注：與對照組比較，△△P＜0.01

組別對照組維拉帕米毛蕊異黃酮濃度（mg/L）-45 100孔數(shù)333 mRNA相對表達量1.24±0.29 0.51±0.10▲▲1.32±0.18

4 討論

毛蕊異黃酮是黃芪的主要有效成分，具有保護心腦血管、肝臟、腎臟和肺臟等作用，為了更好地開發(fā)利用，本實驗通過Caco-2細胞模型，研究毛蕊異黃酮跨膜轉(zhuǎn)運機制，為今后劑型改良及臨床用藥提供參考依據(jù)。

目前國際上對藥物吸收難易有一個公認的判定標準，即根據(jù)即表觀滲透系數(shù)（Papp）的大小來判斷藥物吸收情況，并進一步推導藥物的生物利用度[7]：當Papp＜1.0×10-6cm/s為吸收不良藥物，吸收率在0%～20%；Papp在1.0×10-6cm/s～10×10-6cm/s為吸收中等藥物，吸收率在20%～70%；Papp＞10×10-6cm/s為吸收良好的藥物，吸收率在70%～100%；從本實驗的轉(zhuǎn)運結果可知毛蕊異黃酮中等吸收藥物，生物利用度一般。文獻認為[8-9]，Papp（AP→BL）與Papp（BL→AP）接近時，化合物以被動擴散方式轉(zhuǎn)運；Papp（AP→BL）明顯大于Papp（BL→AP）時，藥物可以被小腸頂側膜的轉(zhuǎn)運載體所攝?。籔app（AP→BL）明顯小于Papp（BL→AP）時，藥物可被小腸頂側膜的轉(zhuǎn)運蛋白外排。根據(jù)美國FDA指導原則Papp（BL→AP）/Papp（AP→BL）≤1，轉(zhuǎn)運藥物可能不是P-gp的底物；Papp（BL→AP）/Papp（AP→BL）≥2，轉(zhuǎn)運藥物可能是P-gp的底物；Papp（BL→AP）/Papp（AP→BL）介于1.5～2時，轉(zhuǎn)運藥物需通過P-gp抑制劑進一步研究，進行評價。本實驗中，毛蕊異黃酮從AP到BL及從BL到AP的轉(zhuǎn)運量與時間和濃度呈正相關增加，毛蕊異黃酮Papp（BL→AP）與Papp（AP→BL）的比值為1～1.5，初步判定毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運方式為被動擴散，本實驗結果與周樂等[10]研究的結果一致。

載體介導轉(zhuǎn)運對溫度非常敏感，溫度對藥物轉(zhuǎn)運影響包括細胞膜上載體的活性、AP側絨毛的運動的快慢、細胞本身的生長活性以及藥物的溶解性等[11]，本實驗結果表明相同濃度下，4℃下毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運量明顯降低。

不同腸段的pH可影響藥物的存在狀態(tài)，影響藥物的溶解度等[12]。毛蕊異黃酮分子中含有酚羥基，堿性環(huán)境相對不利于毛蕊異黃酮吸收，本項目轉(zhuǎn)運實驗中得到了證實。

疊氮化鈉可影響細胞能量代謝進而抑制藥物吸收[13]。結果表明，加入疊氮化鈉毛蕊異黃酮的轉(zhuǎn)運量無顯著變化。說明毛蕊異黃酮的吸收不耗能。

P-gp是多藥耐藥基因MDR1調(diào)控的主要外排蛋白，其主要功能是與底物結合后將其排出細胞[14]。本實驗結果表明，維拉帕米能下調(diào)MDR1基因表達，降低細胞P-gp表達，但毛蕊異黃酮轉(zhuǎn)運過程不受P-gp的外排。

本實驗利用Caco-2模型研究毛蕊異黃酮體外吸收機制，毛蕊異黃酮的吸收以被動擴散為主，不受能量代謝和P-gp外排作用的影響，低溫和堿性環(huán)境不利于其吸收。本實驗研究為毛蕊異黃酮復方配伍藥動學研究奠定基礎。

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（收稿：2015-04-30 修回：2015-05-05）

Transport Characteristics of Calycosin and Its Effect on Multidrug Resistance Gene Expression in Vitro

NIE Gen1,HUANG Xujun1,ZHANG Xinping1,XU允iangling1,MAO Yuanqing1,ZHU Zhen2,CHEN Shigang3.1 ICU, Zhejiang Dongyang Hengdian Group Hospital,Dongyang (322118),China;2 Emergency Room,Hubei Provincial TCM Hospital,Wuhan (430060),China;3 Department of Surgery,Hubei Provincial Women and Children Hospital, Wuhan(430070),China

Objective To investigate the transport characteristics of calycosin across the Caco-2 cell monolayer and its effect on multidrug resistance（MDR1）gene expression.Methods Therapeutic concentration range of calycosin against Caco-2 cell monolayer model was determined by MTT method.The effects of concentration,pH,temperature,P-gp inhibitor（verapamil）and energy metabolism inhibitor（sodium azide）on the absorption of calycosin were assessed.The effect of the suppression of MDR1 on calycosin transport was evaluated.Results The Pappof calycosin transport from apical（AP）side to basolateral（BL）side was over 10-6 cm/s,which showed a good absorption.The transport of calycosin was positively correlated with time and concentration.The transport of calycosin was influenced by the change of temperature[AP to BL：（1.85±0.16）×10-6cm/s at 4℃ vs（3.05±0.13）×10-6cm/s at 25℃ and（3.89±0.31）×10-6cm/s at 37℃,P＜0.05;BL to AP：（1.94±0.29）×10-6cm/s at 4℃ vs（3.49±0.18）×10-6cm/s at 25℃ and（4.06±0.26）×10-6cm/s at 37℃,P＜0.05]and pH[（1.13±0.16）×10-6cm/s at pH=9 vs（3.46±0.32）×10-6cm/ s at pH=5 and（2.72±0.26）×10-6cm/s at pH=7.4,P＜0.05].The transport of calycosin was not affected by MDR1 gene expression.The number of PappBL→AP/PappAP→BL was less than 1.5,indicating that energy metabolism did not play a role in calycosin transport.Conclusion The transport of calycosin across Caco-2 cell monolayer model is passive diffusion,and it is not influenced by the change of P-gp and energy metabolism.Low temperature and alkaline environment is not conducive to the absorption of calycosin.

calycosin;Caco-2 cell model;multidrug resistant gene;passive diffusion

1浙江省東陽市橫店集團醫(yī)院重癥監(jiān)護室（東陽 322118）；2湖北省中醫(yī)院急診科（武漢 430060）；3湖北省婦女兒童醫(yī)院兒外科（武漢 430070）

聶根，E-mail：sun_ming_liang@126.com